郭向東，陳海潮 ，楊 征，楊 光?

1.陜西省人民醫(yī)院心血管內(nèi)二科(西安 710068),2. 陜西省咸陽市三原縣醫(yī)院(三原712000)

主題詞 動脈粥樣硬化/病理生理學(xué) 血紅素氧合酶-1/代謝 @丹紅注射液 兔

動脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)特征性病理變化為動脈內(nèi)膜增厚、變硬，動脈壁彈性減低及粥樣斑塊形成[1]。血紅素氧合酶-1(Hemo oxygenase-1，HO-1)是熱休克蛋白家族成員之一，廣泛存在于肝、脾及網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)和骨髓等組織。氧化應(yīng)激、重金屬、感染、缺血再灌注及其底物血紅素均可誘導(dǎo)HO-1的表達[2-3]。丹紅注射液主要組分為傳統(tǒng)中藥材丹參、紅花的有效成分，具有通經(jīng)舒絡(luò)、活血化淤的功效，動物實驗證實其可延緩、抑制動脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展。本研究選擇36只AS易感動物，遺傳性高脂血癥(Watanabe heritable hyperlipidemic，WHHL)兔為研究對象，建立兔動脈粥樣硬化模型，觀察丹紅注射對兔動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)HO-1表達的影響，探討其抗動脈粥樣硬化的可能機制，為此類藥物用于人類動脈粥樣硬化防治療提供理論依據(jù)。

材料與方法

1 實驗動物、藥品及試劑 選擇西安交通大學(xué)實驗動物中心提供的1月齡健康雄性WHHL兔36只，體重(1.4±0.4)kg。普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，將WHHL兔隨機分為三組各12只：對照組(A組)、高膽固醇飲食組(B組)及疏血通注射液組加高膽固醇飲食組(C組)。A組飼喂正常飼料(120g/d)；B組予以飼喂高膽固醇飼料(120g/d)；C組予以高膽固醇飼料(120g/d)+丹紅注射15ml/kg/d腹腔內(nèi)注射，飼喂12周后將每組WHHL兔處死。試劑盒、緩沖液、抗體稀釋液及HO-1鼠抗兔多克隆抗體均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。光學(xué)顯微鏡、病理圖文分析系統(tǒng)、PCR儀及Gel Doc100 成像系統(tǒng)均有教育部西安交通大學(xué)心血管離子通道疾病重點實驗室提供。

2 研究方法

2.1 模型建立:實驗動物給予耳緣靜脈注射3%戊巴比妥鈉30mg/kg全身麻醉后處死動物，立即開胸分離主動脈，清除血管外組織，生理鹽水沖洗，中性甲醛緩沖液中固定。

2.2 主動脈血管內(nèi)皮HO-1表達水平的測定：采用免疫組織化學(xué)染色法測定三組主動脈血管內(nèi)皮HO-1表達水平。結(jié)果判定：HO-1陽性表達為細胞胞漿中有棕黃色顆粒，隨機選取4個視野，200倍鏡下觀察，圖象分析采用病理組織實時攝像顯微鏡系統(tǒng)攝像，并使用圖像分析軟件分析陽性面積百分比。

2.3 Western Blot技術(shù)測定主動脈血管組織中HO-1蛋白的表達量，提取主動脈血管組織總蛋白，BCA試劑盒測蛋白總濃度，繪出標準曲線，計算出樣品實際濃度(μg/μl)。80mV電壓，100g/L SDS-PAGE凝膠電泳2h； 250mA轉(zhuǎn)膜70min；50g/L脫脂奶粉封閉液，室溫下封閉2h；TBST洗膜3次。加入HO-1(1∶500比例稀釋)、β-actin(1∶5000比例稀釋)一抗，4℃孵育過夜；洗膜3次后加入二抗(1∶5000比例稀釋)室溫下孵育2h；TBST洗膜，10min ，3次；置強化學(xué)發(fā)光試劑ECL底物中化學(xué)反應(yīng)5min；暗室曝光顯示特異的蛋白信號。Gel Doc100 成像系統(tǒng)進行圖像處理，記錄結(jié)果。目的條帶與內(nèi)參(β-actin)條帶吸光面積積分的比值分析目的蛋白。

結(jié) 果

1 三組主動脈動脈粥樣硬化程度比較 C組AS斑塊面積與動脈內(nèi)膜面積比值、內(nèi)膜厚度、內(nèi)膜/中膜厚度比均分別低于B組，而均分別高于A組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)，見表1。

表1 各組斑塊面積百分比比較各組內(nèi)膜厚度、內(nèi)膜/中膜厚度比

注：與A組比較，*P<0.01；與B組比較，?P<0.05

2 三組HO-1特異性染色表達陽性面積比較 A組、B組和C組血管壁HO-1表達分別為(15.71±3.52)%、(38.49±8.86)%、(26.45±3.92)%。經(jīng)比較后發(fā)現(xiàn)，C組HO-1表達高于A組而低于B組，組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，圖1)。

3 三組間動脈壁及AS斑塊組織HO-1蛋白表達比較 采用Western Blot技術(shù)測定三組動脈壁及AS斑塊組織HO-1蛋白水平，顯示心房組織中HO-1的蛋白相對表達在A、B、C組分別為(0.452±0.073)、(1.657±0.297)、(1.082±0.263)。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理后提示C組HO-1蛋白的表達高于A組而低于B組，組間比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖2)。

A:正常對照; B:高脂飲食組; C:高膽固醇飲食加丹紅注射

圖2 三組間HO-1蛋白的表達

HO-1是一種應(yīng)激性反應(yīng)蛋白，其通過抗氧化應(yīng)激、抗細胞增殖、抗凋亡、抑制血小板聚集及炎癥損傷、調(diào)節(jié)血管壁的緊張性和參加細胞內(nèi)信號的傳遞等機制對心血管系統(tǒng)起著保護的作用[4]。已有研究證實，冠心病患者的內(nèi)皮細胞、動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)以及平滑肌細胞內(nèi)HO-1的表達增加[5]，HO-1及HO-l的mRNA在動脈粥樣硬化發(fā)展的過程中表現(xiàn)出逐漸增加的趨勢[6]。HO-1抗動脈粥樣硬化機制可歸納為：①HO-1通過講解游離膽紅素、抑制低密度脂蛋白的氧化修飾作用而顯著減低血管內(nèi)皮的氧化應(yīng)急損傷；②HO-1的代謝產(chǎn)物一氧化碳可抑制血管內(nèi)皮凋亡、促進內(nèi)皮增值及損傷血管內(nèi)皮修復(fù)；③HO-1可通過抗炎機制拮抗動脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展[7-8]。

丹紅注射液的主要成分有丹參素、丹參酮、紅花苷、紅花黃色素等，為傳統(tǒng)中藥丹參、紅花有效提取物所得復(fù)合劑。研究證實：丹紅注射液具有降低血脂、抑制血小板聚集、改善內(nèi)皮功能等作用，從而在臨床上廣泛用于心、腦血管疾病及外周血管等疾病的治療[9-10]。相關(guān)研究證實：丹紅注射液具有逆轉(zhuǎn)內(nèi)皮損傷、抑制hs-CRP、TNF-α、IL-6等炎癥因子表達的作用[11]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認為我國某些傳統(tǒng)地道中藥材的有形成分如多酚化合物、黃酮類物質(zhì)可通過特殊的細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路上調(diào)HO-1表達進而發(fā)揮其保護內(nèi)皮、抗氧化應(yīng)急等功能[12]。由此可見，HO-1與丹紅注射液在拮抗動脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展的過程中具有協(xié)同作用。

本研究以AS易感動物WHHL兔為研究對象，建立兔動脈粥樣硬化模型，應(yīng)用免疫組織化學(xué)法及 Western blot法觀察丹紅注射液對兔動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)HO-1表達的影響。實驗結(jié)果顯示：正常新西蘭兔進食高膽固醇飼料后，主動脈血管壁HO-1表達陽性面積比明顯升高，高膽固醇飲食加丹紅注射液組主動脈血管壁HO-1表達陽性面積少于高膽固醇飲食組，這與相關(guān)報道一致[13]。究其原因，一方面可能為丹紅注射液組減少促炎因子的釋放，從而發(fā)揮其抗炎作用，進而上調(diào)了HO-1的表達；另一方面可能與丹紅注射液的降低血脂、抑制血小板聚集、改善內(nèi)皮功能等作用有關(guān)，這進一步證實了丹紅注射液可能通過上調(diào)HO-1的表達從而發(fā)揮起其抗動脈粥樣硬化的作用。