張 瑩，文紹敦，童 麗，李永平

(青海大學(xué)，青海西寧810001)

已有證據(jù)表明，性激素分泌紊亂與胰島素抵抗(insulin resistance，IR)在多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome，PCOS)的發(fā)展進(jìn)程中占有重要地位。其中，IR是PCOS重要的臨床特征，約50%～70%的PCOS患者存在不同程度的IR［1］。其機(jī)制可能與胰島素受體后信號(hào)傳導(dǎo)障礙有關(guān)，尤其是磷脂酰肌醇 3 激酶(phosphoinositide3－kinase，PI3K)介導(dǎo)的胰島素信號(hào)通路(PI3K/Akt)［2］。中醫(yī)認(rèn)為，PCOS屬腎、肝、脾三臟功能失調(diào)，從而引起腎－天癸－沖任－胞宮軸的異常。本研究應(yīng)用針刺改善生殖功能障礙聯(lián)合五子衍宗丸補(bǔ)腎治療，觀察對(duì)PCOS－IR模型大鼠生殖內(nèi)分泌及PI3K/Akt信號(hào)通路的影響，探討其可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

健康清潔級(jí)21日齡Wistar雌鼠32只，體質(zhì)量(55±5)g，由甘肅獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供［許可證號(hào):SYXK(甘)2014－0002］，適應(yīng)性飼養(yǎng)2天。隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型組、二甲雙胍組和針?biāo)幝?lián)合組，每組8只。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥品、試劑和儀器

主要藥品和試劑:脫氫表雄酮(DHEA，上海源葉生物科技有限公司)，注射用油(北亞試劑，國(guó)藥準(zhǔn)字H21024303)，二甲雙胍(上海施貴寶，國(guó)藥準(zhǔn)字H20023370)，五子衍宗丸(北京同仁堂，國(guó)藥準(zhǔn)字Z11020188)?？崭挂葝u素(FINS)ELISA試劑盒、卵泡刺激素(FSH)ELISA試劑盒、黃體生成素(LH)ELISA試劑盒、雌二醇(E2)ELISA試劑盒、睪酮(T)ELISA試劑盒(北京博奧拓達(dá)科技有限公司)。反轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒(Takara)。引物(Qiagen)。

主要儀器:血糖儀(強(qiáng)生穩(wěn)擇易)，低溫離心機(jī)(5424R，艾本德)，酶標(biāo)儀(RT－6500，雷杜)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(LightCycler 96)。

1.3 模型制備方法［3］

根據(jù)Lee MT等的方法，除空白對(duì)照組外，其余大鼠項(xiàng)背部皮下注射 DHEA(6mg/100g體重，溶于0.2mL注射用油中)，連續(xù)注射20天，空白對(duì)照組同期項(xiàng)背部皮下注射注射用油(0.2mL)。注射第10天開(kāi)始，取陰道涂片連續(xù)觀察兩個(gè)動(dòng)情周期，以連續(xù)出現(xiàn)角化細(xì)胞判定為PCOS造模成功。將造模成功的PCOS大鼠于當(dāng)晚8時(shí)禁食，次晨8時(shí)眶靜脈取血做空腹血糖(FPG)和 FINS檢測(cè)。計(jì)算HOMA－IR，HOMA－IR=FPG(mmol/L)× FINS(mU/L)/22.5。實(shí)驗(yàn)中將HOMA－IR＞2.8的PCOS大鼠作為成功模型。

1.4 各組處理方法

除空白對(duì)照組外，其余各組大鼠為防止自身恢復(fù)排卵，在治療的同時(shí)每日于皮下注射溶于注射用油的DHEA(劑量同上)。二甲雙胍組給予二甲雙胍溶液(0.012g/mL)灌胃;針?biāo)幝?lián)合組首先針刺治療，根據(jù)中國(guó)針灸學(xué)會(huì)分會(huì)制定的“動(dòng)物針灸穴位圖譜”選用雙側(cè)“腎俞”“胰俞”“關(guān)元”“子宮”“三陰交”“豐隆”穴，直刺3～5 mm，提插捻轉(zhuǎn)強(qiáng)刺激并留針5分鐘后出針;然后給予五子衍宗丸溶液(0.14g/mL)灌胃，連續(xù) 28 天。

1.5 標(biāo)本采集和儲(chǔ)存方法

末次治療當(dāng)晚禁食(水)12小時(shí)，次晨8時(shí)尾靜脈采血測(cè)FPG，然后以10%水合氯醛(0.35mL/100g)行腹腔注射麻醉，于腹主動(dòng)脈采血離心(3000r/min)15分鐘，分離血清，－20℃保存?zhèn)溆?分離兩側(cè)卵巢，一側(cè)卵巢置于4%多聚甲醛中固定，另一側(cè)卵巢以液氮速凍，－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 觀察指標(biāo)及方法

1.6.1 卵巢形態(tài)學(xué)的檢查

各組大鼠取一側(cè)卵巢，予4%多聚甲醛固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，切片(5μm)，常規(guī)脫蠟、染色、脫水、透明、封片，置顯微鏡下觀察。

1.6.2 性激素及胰島素抵抗指數(shù)的測(cè)定

血清標(biāo)本采集后，采用ELISA法測(cè)定FINS、FSH、LH、E2和T，并計(jì)算HOMA－IR。嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。標(biāo)準(zhǔn)品孔加50μL不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，樣本孔加待測(cè)樣本40μL，再加10μL樣本稀釋液，除空白孔外每孔加入酶標(biāo)試劑100μL，封板溫育(37℃)1小時(shí);稀釋洗滌液，每孔加滿洗滌液，靜置1分鐘后棄去拍干，反復(fù)5次;每孔加底物A和B各50μL，避光溫育(37℃)15分鐘，加終止液50μL，在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔吸光度，計(jì)算樣本濃度。

1.6.3 卵巢組織 IRS－1、PI3K mRNA 的表達(dá)測(cè)定

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)卵巢組織IRS－1、PI3K mRNA的表達(dá)。標(biāo)本在液氮中研磨，用Trizol法提取組織RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以LightCycler96系統(tǒng)行實(shí)時(shí)熒光定量，引物序列見(jiàn)表1，反應(yīng)體系如下:SYBR Green mix 10.0 μL，引物 0.8 μL，cDNA 模板 2.0 μL，水 7.2 μL。擴(kuò)增反應(yīng)程序:95℃，5 s;60℃，30 s，40個(gè)循環(huán)。將待測(cè)基因與內(nèi)參β－actin的比值作為待測(cè)基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果采用 2－ΔΔCt計(jì)算。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物Table 1 Primer sequences for Real－time PCR

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料數(shù)據(jù)采用珋x±s表示，組間采用單因素方差分析，多重兩兩比較方差齊時(shí)采用 LSD－t檢驗(yàn)，方差不齊時(shí)采用Tamhane's T2檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn) α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠卵巢病理切片圖(圖1)

圖1顯示，空白對(duì)照組大鼠卵巢可見(jiàn)不同發(fā)育階段的卵泡;模型組卵巢呈多囊樣改變，閉鎖卵泡增多，直徑較大，且未見(jiàn)黃體分布;二甲雙胍組和針?biāo)幝?lián)合組可見(jiàn)不同發(fā)育階段的卵泡及少數(shù)黃體。

圖1 各組大鼠卵巢HE染色病理圖(HE×10)Figure 1 Pathological status of the ovary in each group(HE×10)

2.2 各組間性激素水平(表2)

表2顯示，與空白對(duì)照組比較，模型組大鼠血清FSH和E2水平明顯降低(P＜0.01)，LH和T水平顯著升高(P＜0.01)。與模型組比較，二甲雙胍組和針?biāo)幝?lián)合組血清FSH和E2水平升高(P＜0.01)，LH和T水平降低(P＜0.01)。各治療組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

表2 各組大鼠性激素水平比較表(±s)Table 2 Comparison of sex kind of hormones in each group(±s)

表2 各組大鼠性激素水平比較表(±s)Table 2 Comparison of sex kind of hormones in each group(±s)

*:與空白對(duì)照組比較，P＜0.01;#:與模型組比較，P＜0.01.

組別 n FSH(IU/L)LH(mIU/mL)E2T(pmol/L)(pg/mL)空白對(duì)照組 8 3.61±1.18 11.22±4.50 24.62±4.19 17.44±2.87模型組 8 1.08±0.44* 18.24±4.85* 6.02±1.17* 95.55±17.05*二甲雙胍組 8 2.88±0.44# 12.47±2.12# 19.66±2.60# 18.07±2.34#針?biāo)幝?lián)合組 8 3.38±0.41# 11.24±2.72# 24.19±3.60# 20.28±1.52#F 21.756 6.465 62.594 154.543 P 0.000 0.002 0.000 0.000

2.3 各組間胰島素抵抗指數(shù)(表3)

表3顯示，與空白對(duì)照組比較，模型組大鼠FINS水平及 HOMA－IR 值明顯升高(P＜0.01)，F(xiàn)PG值稍高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。與模型組比較，二甲雙胍組和針?biāo)幝?lián)合組FPG降低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，F(xiàn)INS水平及 HOMA－IR 值降低(P＜0.01)，各治療組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

表3 各組大鼠胰島素抵抗情況比較表(±s)Table 3 Comparison of insulin resistance status in each group(±s)

表3 各組大鼠胰島素抵抗情況比較表(±s)Table 3 Comparison of insulin resistance status in each group(±s)

*:與空白對(duì)照組比較，P＜0.01;#:與模型組比較，P＜0.01.

組別 n FPG(mmol/L)FINS(mU/L) HOMA－IR空白對(duì)照組 8 4.20±0.76 16.24±3.55 3.03±0.77模型組 8 4.85±0.26 48.19±8.26* 10.41±2.06*二甲雙胍組 8 4.34±0.92 22.39±4.30# 4.44±1.83#針?biāo)幝?lián)合組 8 4.09±0.51 17.71±6.02# 3.29±1.43#F 2.077 52.668 37.608 P 0.126 0.000 0.000

2.4 各組大鼠卵巢組織IRS－1、PI3K mRNA表達(dá)水平(表4)

表4顯示，與空白對(duì)照組比較，模型組大鼠卵巢組織中IRS－1、PI3K mRNA下降，說(shuō)明胰島素信號(hào)通路受到抑制。與模型組比較，二甲雙胍組和針?biāo)幝?lián)合組 IRS－1、PI3K mRNA 顯著上調(diào)(P＜0.01)。各治療組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

表4 各組大鼠卵巢組織IRS－1、PI3K mRNA表達(dá)情況(±s)Table 4 The expression of IRS－1 and PI3K mRNA in ovarian tissue in each group( ±s)

表4 各組大鼠卵巢組織IRS－1、PI3K mRNA表達(dá)情況(±s)Table 4 The expression of IRS－1 and PI3K mRNA in ovarian tissue in each group( ±s)

#:與模型組比較，P＜0.01.

組別 n IRS－1 mRNA PI3K mRNA空白對(duì)照組 8 1.06±0.33 1.04±0.35模型組 8 0.75±0.39 0.82±0.25二甲雙胍組 8 3.10±0.75# 1.97±0.58#針?biāo)幝?lián)合組 8 3.47±1.41# 1.70±0.48#F 22.133 12.402 P 0.000 0.000

3 討論

IR是PCOS的重要臨床特征，過(guò)量的胰島素通過(guò)神經(jīng)－內(nèi)分泌－免疫網(wǎng)絡(luò)的下丘腦－垂體－卵巢軸在垂體水平促進(jìn)LH的分泌，使雄激素的合成和分泌增加，結(jié)果將直接導(dǎo)致胰島素和雄激素同時(shí)作用于肝臟抑制性激素結(jié)合球蛋白的分泌，導(dǎo)致血清T和E2水平增高［4］。但本實(shí)驗(yàn)E2水平降低，可能原因是DHEA為外源性雄激素，注射入體內(nèi)使雄激素升高，但難以區(qū)分內(nèi)源性和外源性，影響其轉(zhuǎn)換為雌激素，故E2水平降低［5］。雌激素又同時(shí)對(duì)FSH分泌呈負(fù)反饋?zhàn)饔?，使FSH水平相對(duì)降低，從而形成雄激素過(guò)多、持續(xù)無(wú)排卵，最終導(dǎo)致卵巢多囊樣改變［6－7］。研究表明雄激素能抑制 PI3K/Akt信號(hào)通路的傳導(dǎo)，從而引起IR［8］。綜上所述，雄激素作為中間環(huán)節(jié)，可使生殖內(nèi)分泌發(fā)生變化及PI3K/Akt通路被抑制，本實(shí)驗(yàn)采用DHEA項(xiàng)背部皮下注射的方法誘導(dǎo)PCOS－IR模型大鼠，模擬雄激素過(guò)多及排卵障礙的病癥。

從傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的角度，PCOS當(dāng)屬腎、肝、脾功能失調(diào)，痰濕、瘀血等病理因素相互錯(cuò)雜，且虛實(shí)夾雜的病癥［9－11］。腎－天癸－沖任－胞宮中醫(yī)生殖軸的異常致本病的發(fā)生。因此，本研究針灸治療選擇補(bǔ)腎益精，疏通任脈之氣為主，穴位選擇根據(jù)腎－天癸－沖任－胞宮軸，選用腎俞穴以補(bǔ)腎益精，關(guān)元穴調(diào)理沖任，局部選穴選擇治療婦科疾病經(jīng)驗(yàn)要穴(子宮穴);根據(jù)PCOS病因病機(jī)選取腎肝脾三經(jīng)交會(huì)穴三陰交調(diào)理三臟，豐隆穴祛濕化痰，最后選用胰腧穴針對(duì)胰島素抵抗。五子衍宗丸作為古今“種子第一方”則主要以補(bǔ)腎為主，方中菟絲子、枸杞子為君藥補(bǔ)腎益精，滋補(bǔ)肝脾;覆盆子、五味子為臣藥補(bǔ)腎養(yǎng)肝，澀精止遺;車前子為佐藥利水祛痰，五藥共奏具有補(bǔ)腎益精的作用［12］。近年來(lái)，五子衍宗丸多用于男性生殖系統(tǒng)疾病。但有研究表明，在治療女性生殖系統(tǒng)疾病方面該藥具有類性激素作用，因而可以調(diào)節(jié)女性更年期癥狀，治療女性不孕等［13］。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示針?biāo)幝?lián)合治療后，大鼠血清性激素FSH和E2水平明顯升高，LH和T水平明顯下降，F(xiàn)INS水平及HOMA－IR 值明顯下降，IRS－1、PI3K mRNA 水平顯著上調(diào)，且與二甲雙胍組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明針刺聯(lián)合五子衍宗丸可以更好改善生殖內(nèi)分泌水平及IR情況。

綜上所述，針?biāo)幝?lián)合治療PCOS－IR模型大鼠療效顯著，其機(jī)制可能是通過(guò)改善下丘腦垂體卵巢軸以恢復(fù)排卵，通過(guò)上調(diào)PI3K/Akt信號(hào)通路以改善IR。但是，對(duì)整個(gè)PI3K/Akt信號(hào)通路的影響，還有待進(jìn)一步研究證明。