趙高宇，馬金蘭，張瑞霞

(1.青海大學研究生院;2.青海大學附屬醫(yī)院眼科;3.青海大學附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科)

視網(wǎng)膜血管性疾病的發(fā)病基礎(chǔ)為新生血管發(fā)生導致的視網(wǎng)膜缺血、血管內(nèi)皮細胞滲漏等病理改變［1］，新生血管的發(fā)生對眼部結(jié)構(gòu)和功能造成的損害是引起視力障礙的重要原因。視網(wǎng)膜新生血管的發(fā)展必須依賴缺氧誘導的血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)，這是視網(wǎng)膜新生血管形成的一個主要因素。VEGF家族屬于血小板源性生長因子(The platelet－derived growth factor，PDGF)超家族，目前由六個不同的成員組成，即VEGF－A、VEGF－B、VEGF－C、VEGF－D、VEGF－E 和胎盤生長因子(placental growth factor，PLGF)，VEGF－A在 VEGF家族中所占比例最高［2］?，F(xiàn)已明確VEGF－A在視網(wǎng)膜新生血管的形成中的作用機制，但是VEGF－B對血管生成的影響研究一直有爭論。本研究應(yīng)用一種新的視網(wǎng)膜新生血管成模方法，即在模擬低氧環(huán)境下觀察大鼠視網(wǎng)膜新生血管形成與否，同時觀察視網(wǎng)膜VEGF－B的表達情況，綜合探討VEGF－B與低氧誘導大鼠視網(wǎng)膜新生血管的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及主要試劑

雄性SD大鼠體重190～250 g，購自南京青龍山動物繁殖場。兔抗VEGF－B多克隆抗體購自英國abcam公司;異硫氰酸熒光素標記的葡聚糖(Fluorescein－dextran，F(xiàn)ITC－dextran)購自美國 Thermo公司;大鼠VEGF－B酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)試劑盒購自中國DLDEVELOP公司;離心柱式組織RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)試劑盒及實時熒光定量PCR(Quantitative Real－time PCR，RT－PCR)相關(guān)試劑盒購自中國天根生化科技有限公司。

1.2 分組和模型

所有動物遵循視覺和眼科學研究學會(Association for Research in Vision and Ophthalmology，ARVO)關(guān)于眼科動物的處理規(guī)定，購回后在青海大學高原醫(yī)學研究中心飼養(yǎng)，大鼠分為四組:低氧空白組、低氧藥物組、低氧藥物對照組和常氧對照組，每組12只。低氧處理大鼠置于青海大學醫(yī)學院低壓氧艙(中航工業(yè)風雷公司，模擬海拔高度5 000 m，大氣壓力50±2kPa，氧氣含量21±1%)。低氧藥物組大鼠在進艙前一天在玻璃體腔注射兔抗VEGF－B多克隆抗體［0.2%(W/V)，50μg/kg］;低氧藥物對照組大鼠玻璃體腔注射同等體積的溶媒(50%PBS+50%甘油)。早晚各一次進艙添加飼料、水，常氧對照組大鼠在常氧恒溫條件下飼養(yǎng)。大鼠進入低壓氧艙時間為7 d，7 d后取出與常氧組一起麻醉(10%水合氯醛，0.3g/kg)后處死取材。

1.3 實驗方法和檢測指標

(1)視網(wǎng)膜 FITC－dextran鋪片:將 FITC－dextran(2000KD，50g/L)溶于無菌生理鹽水，離心(10000r/min，3min)后取上清備用，大鼠常規(guī)麻醉后固定，觸及心尖對應(yīng)體表位置，在此處垂直進針，感受到針尖搏動感再進針少許，回抽見血后將1 mL FITC－dextran注入左心室，觀察0.5～1 h，發(fā)現(xiàn)大鼠口周、四肢末端及耳鼻等外表粘膜處變黃后處死大鼠，取右眼置于4%(W/V)多聚甲醛中固定1 h，沿角膜緣環(huán)形切開，剝離晶狀體和玻璃體，分離視網(wǎng)膜感覺層和色素上皮層，將視網(wǎng)膜感覺層于PBS緩沖液中輕輕漂洗后取出置于載玻片上，穿刺刀沿視網(wǎng)膜中心向外緣放射狀切開，甘油封片，置于熒光顯微鏡下觀察，并標記無血管區(qū)及新生血管區(qū);

(2)ELISA法測大鼠玻璃體VEGF－B蛋白含量:大鼠常規(guī)麻醉后處死，取雙側(cè)眼球沿角膜緣環(huán)形切開，剝離晶狀體，緩慢收集玻璃體于EP管中，離心(2500r/min，10min)后取上清凍存于－80℃冰箱備用，用ELISA法測玻璃體VEGF－B蛋白含量;

(3)RT－qPCR法測視網(wǎng)膜VEGF－B mRNA的表達水平:分離視網(wǎng)膜感覺層和色素上皮層，將雙側(cè)視網(wǎng)膜感覺層放入無菌PBS緩沖液中漂洗后取出，視網(wǎng)膜放入含500μL裂解液的EP管中，劇烈震蕩直至完全溶解，離心(12000r/min，5min)后取上清進行視網(wǎng)膜組織總RNA提取，反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA;檢索Genbank獲得vegf－b和β－actin的核酸序列，在線設(shè)計vegf－b特異引物以及內(nèi)參β－actin的特異引物(http://www.idtdna.com/scitools/Applications/Real-TimePCR/)，vegf－b 上游引物序列:GCAACACCAAGTCCGAATG，下游引物序列:CTTCACAG-CACTCTCCTTTCT，擴增產(chǎn)物片段長 124 bp;β－actin上游引物序列:CACTTTCTACAATGAGCTGCG，下游引物序列:CTGGATGGCTACGTACATGG，擴增產(chǎn)物片段長148 bp，引物均由中國華大基因研究院合成。將引物與cDNA加入反應(yīng)體系中進行實時熒光定量PCR，測得目的基因以及內(nèi)參基因的Ct值，采用比較Ct法進行相對定量結(jié)果分析。

1.4 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行，統(tǒng)計結(jié)果以均數(shù)±標準差(珋x±s)表示，四組數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析采用單因素方差分析法;P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 低氧誘導視網(wǎng)膜新生血管大鼠模型的建立

為探討VEGF－B在視網(wǎng)膜新生血管形成中的作用，設(shè)計了模擬低壓低氧條件下7 d誘導視網(wǎng)膜新生血管大鼠模型，在模型中檢測了視網(wǎng)膜VEGF－B mRNA的表達和玻璃體VEGF－B蛋白水平的變化。在這個模型中，視網(wǎng)膜新生血管在7 d低氧空白組和低氧藥物對照組最明顯。常氧對照組(圖1A)顯示了FITC－dextran灌注的正常視網(wǎng)膜血管形態(tài)，低氧空白組(圖1B)和低氧藥物對照組(圖1C)顯示了低氧不給藥以及藥物對照情況下視網(wǎng)膜血管形態(tài)，低氧給藥組(圖1D)則顯示了低氧下給予抗VEGF－B抗體后視網(wǎng)膜血管形態(tài)。圖1B和圖1C中視網(wǎng)膜中央血管的部分丟失并出現(xiàn)新生血管叢，可見血管周圍熒光素滲漏，而圖1D上述情況有所減輕。

A為常氧對照組;B為單純低氧條件下7d后視網(wǎng)膜鋪片結(jié)果;C為低氧同時給予溶媒作為低氧藥物對照組的視網(wǎng)膜鋪片結(jié)果;D為低氧條件下同時給予玻璃體注射抗VEGF－B抗體干預(yù)處理后的視網(wǎng)膜鋪片結(jié)果.A顯示了正常視網(wǎng)膜血管形態(tài)，B和C顯示了視網(wǎng)膜中央血管的部分丟失(白線圈的不規(guī)則區(qū)域)和新生血管叢(箭頭所指)，并可見血管周圍熒光素滲漏，而D顯示上述情況較B、C有所減輕.Figure 1 Observation of FITC－dextran perfusion of the retina under the fluorescence microscope

2.2 抗VEGF－B抗體影響視網(wǎng)膜VEGF－B mRNA的表達

VEGF蛋白家族屬于分泌型蛋白，視網(wǎng)膜感覺層細胞表達VEGF－B并可通過旁分泌至玻璃體中，檢測玻璃體VEGF－B的含量，可間接反映視網(wǎng)膜VEGF－B mRNA的表達情況。各組大鼠眼球提取玻璃體使用ELISA檢測VEGF－B蛋白含量。表1顯示，低氧空白組和低氧藥物對照組玻璃體VEGF－B蛋白濃度分別為 24.84±4.26 pg/mL 和 24.83±5.54 pg/mL，均高于常氧組(17.80±3.58pg/mL)和低氧藥物組(19.78±2.82pg/mL)(P＜0.05);RT－qPCR 檢測視網(wǎng)膜感覺層VEGF－B的mRNA水平顯示，玻璃體注射抗VEGF－B抗體處理可抑制VEGF－B mRNA的表達。這些結(jié)果表明，抗VEGF－B抗體處理后可降低視網(wǎng)膜VEGF－B mRNA的表達。

Table 1 Determination of VEGF－B protein content in the vitreous cavity and expression of VEGF－B mRNA in the retina of four groups of rats(±s)

Table 1 Determination of VEGF－B protein content in the vitreous cavity and expression of VEGF－B mRNA in the retina of four groups of rats(±s)

*:P＜0.05;#:P＜0.01 V.S.常氧對照組.

組別 n VEGF－B濃度(pg/mL) VEGF－B mRNA表達常氧對照組 7 17.8050±3.5822 1.0000±0.3356低氧藥物組 7 19.7849±2.8299# 0.8219±0.3839低氧空白組 7 24.8470±4.2602# 1.8297±0.6169*低氧藥物對照組 7 24.8349±5.5479# 2.3178±0.9481*F 84.204 7.727 P＜0.001 0.001

3 討論

視網(wǎng)膜血管性疾病，包括年齡相關(guān)黃斑變性(age－related macular degeneration，AMD)、糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy，DR)、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變(retinopathy of prematurity，ROP)和缺血性視網(wǎng)膜靜脈阻塞(retinal vein occlusion，RVO)，視網(wǎng)膜新生血管發(fā)生發(fā)展的過程非常復(fù)雜，包括有巨噬細胞、血管內(nèi)皮細胞、色素上皮細胞等炎性細胞的多種細胞和血管生成因子、血管生成抑制因子等多種細胞因子參與，構(gòu)成一個復(fù)雜的互相作用網(wǎng)絡(luò)，最終對視力造成嚴重損害。

以往在考察視網(wǎng)膜新生血管的形成以及研發(fā)抗血管生成藥物時，將不同的動物視網(wǎng)膜新生血管造模方法用于研究臨床不同類型的視網(wǎng)膜血管性疾病，如高氧誘導視網(wǎng)膜新生血管病變的動物模型主要用于研究臨床ROP的發(fā)病機制及治療［3］。高氧誘導動物視網(wǎng)膜病變常用于研究視網(wǎng)膜新生血管［4］，但是觀察早產(chǎn)小鼠氧誘導視網(wǎng)膜病變可能不足以代表臨床眼科所有類型的視網(wǎng)膜新生血管，尤其是在青少年以及成年患者。因此，探尋非早產(chǎn)動物且與臨床眼科各類型視網(wǎng)膜新生血管疾病特征符合的視網(wǎng)膜新生血管造模方法，對于研究此類疾病發(fā)病機制及其他領(lǐng)域有著重要作用。

視網(wǎng)膜新生血管形成依賴于缺氧誘導的血管內(nèi)皮生長因子［5］。缺氧在視網(wǎng)膜新生血管性疾病發(fā)病機制中起了關(guān)鍵的作用，臨床上視網(wǎng)膜新生血管的形成多數(shù)是在血管阻塞性疾病引起的視網(wǎng)膜缺血缺氧后發(fā)生，而在動物視網(wǎng)膜血管阻塞造模過程中，有成功率低、操作較復(fù)雜等缺點。高原環(huán)境較平原有其獨特的特點，低壓、低氧是許多高原特有疾病發(fā)病機理的病理生理學基礎(chǔ)。大腦和視網(wǎng)膜等結(jié)構(gòu)富含神經(jīng)元組織，其對缺氧極其敏感，急進高原后由于急性缺氧可導致高海拔視網(wǎng)膜病變(high altitude retinopathy，HAR)，其特征為視網(wǎng)膜血管迂曲、視網(wǎng)膜出血、滲出及水腫，嚴重影響視覺功能［6］。有研究［7］發(fā)現(xiàn)，處在急性低壓低氧環(huán)境下6 h的動物心肌和大腦組織有著明顯的缺氧后病理改變，表現(xiàn)為心肌細胞和神經(jīng)元細胞的腫脹、空泡化，以及組織血管擴張等。黃海香［8］等研究發(fā)現(xiàn)，模擬高海拔低氧環(huán)境，大鼠在較短時間(6h)內(nèi)即可出現(xiàn)視網(wǎng)膜組織水腫、層次結(jié)構(gòu)紊亂以及神經(jīng)節(jié)細胞腫脹變形，部分細胞出現(xiàn)核固縮、溶解等病理形態(tài)改變，視網(wǎng)膜血管出現(xiàn)擴張、淺層血管出血等征象，且海拔越高視網(wǎng)膜組織損傷越嚴重，可能與上調(diào)HIF－1α和p53的表達有關(guān)。既往研究報道［9］，在我國高海拔地區(qū)(西寧)，糖尿病視網(wǎng)膜病變發(fā)生率高于平原地區(qū)?；谏鲜鲅芯拷Y(jié)果，在高海拔低氧低氣壓條件下，視網(wǎng)膜組織可出現(xiàn)典型的缺氧后病理改變。本研究為探究低壓低氧環(huán)境下動物視網(wǎng)膜新生血管生成與否，且為了觀察視網(wǎng)膜血管更明顯的缺氧后改變，設(shè)計將模擬超高海拔(5000m)環(huán)境的時間延長為7 d，缺氧誘導6～7 w大鼠視網(wǎng)膜新生血管形成，使用FITC－dextran灌注視網(wǎng)膜血管造影觀察視網(wǎng)膜新生血管情況。本研究結(jié)果顯示，低壓低氧條件下，大鼠視網(wǎng)膜中央血管部分丟失和出現(xiàn)新生血管叢，并可見熒光素的滲漏，這與以往報道的研究結(jié)果類似。但此方法造模的大鼠視網(wǎng)膜新生血管的數(shù)量，以及血管的丟失不如高氧誘導新生大鼠視網(wǎng)膜病變明顯，考慮與大鼠視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)已成型有關(guān)。在低壓低氧的誘導因素下，其形成的視網(wǎng)膜病變特征與臨床上部分成人視網(wǎng)膜血管性疾病的病變特征更加接近。

VEGF最主要的作用是促進動脈、靜脈以及淋巴內(nèi)皮細胞有絲分裂。除此以外，VEGF還有增加內(nèi)皮細胞滲透性、遷移性的作用［10］?，F(xiàn)已明確VEGF－A在視網(wǎng)膜新生血管的形成中的作用機制，但是對于VEGF－B的研究一直有爭論。VEGF－B主要在心臟、中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system，CNS)和棕色脂肪組織(brown adipose tissue，BAT)表達［11］。VEGF－B的作用似乎是多方面的，一些研究表明 VEGF－B 能夠抑制新生血管形成［12－15］。在退行性條件下，對不同類型的血管細胞抑制其凋亡(內(nèi)皮細胞、周細胞及平滑肌細胞)，緩解血管變性，而在高水平的促血管生成生長因子環(huán)境中VEGF－B作為抑制因子存在，確保均衡的血管密度和組織生長［14，15］。Huang D 等研究發(fā)現(xiàn)，VEGF－B 可以抑制高血糖和哌加他尼誘導的視網(wǎng)膜細胞的凋亡［16］。然而也有一些研究有著相反的結(jié)論，認為VEGF－B會促進視網(wǎng)膜血管生成以及增加VEGF－A的生物利用度［17，18］。我們的研究結(jié)果是低氧組大鼠視網(wǎng)膜VEGF－B mRNA的表達高于常氧對照組，且玻璃體VEGF－B的含量在各組中的變化趨勢與其相似。而在低氧環(huán)境下玻璃體腔注射抗VEGF－B抗體組大鼠視網(wǎng)膜VEGF－B mRNA的表達低于其他低氧組，與正常對照組相近，其視網(wǎng)膜鋪片結(jié)果顯示新生血管以及中央血管的丟失情況也較其他低氧組減輕。故我們推測在低壓低氧條件下，視網(wǎng)膜組織上調(diào)缺氧誘導因子等缺氧相關(guān)因子，通過缺氧相關(guān)通路上調(diào)視網(wǎng)膜VEGF－B的表達，進而促進新生血管的形成。通過給予抗VEGF－B抗體干預(yù)處理后，大鼠視網(wǎng)膜新生血管情況較低氧組減輕，且視網(wǎng)膜VEGF－B mRNA的表達也較其他低氧組降低，說明VEGF－B在低氧誘導大鼠新生血管的生成以及調(diào)控視網(wǎng)膜VEGF－B mRNA的表達水平起了很重要的作用。

綜上所述，VEGF－B在低氧誘導視網(wǎng)膜新生血管形成過程中發(fā)揮了促進作用，而經(jīng)抗VEGF－B抗體干預(yù)后可有效抑制這一作用。