張海燕，張 華，連紫宛，高笑笑，王 剛*

(1.青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院;2.青海省人民醫(yī)院，青海西寧810001)

本研究組前期的研究結(jié)果顯示，雪靈芝(Areneria Kensuensis)水溶性提取物具有抑制腫瘤生長(zhǎng)、激活機(jī)體免疫的作用［1－2］。以此為基礎(chǔ)，通過(guò)建立S180荷瘤小鼠模型進(jìn)行體內(nèi)研究，探討雪靈芝粗多糖(Arenaria kansuensis crude polysaccharide，AKCP)對(duì)荷瘤鼠的腫瘤生長(zhǎng)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物與細(xì)胞

無(wú)特定病原體(SPF)級(jí)Balb/c小鼠，雌雄各半，體重(20±2)g，購(gòu)自空軍軍區(qū)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證編號(hào):0014827，動(dòng)物許可證號(hào):SCXK(軍)2012－0007;S180細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。

1.1.2 主要試劑與儀器

雪靈芝(青海九康醫(yī)藥保健品有限公司)，注射用環(huán)磷酰胺(CTX，江蘇盛迪醫(yī)藥有限公司)，Trizol Reagent(美國(guó) Life technologies公司)，GoScriptTMReverse Transcription System(美國(guó) Promega公司)，SuperReal熒光定量預(yù)混試劑(北京天根生化科技有限公司)，組織/細(xì)胞裂解液、BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)，SuperECL Plus超敏發(fā)光液(普利萊基因技術(shù)有限公司)，兔抗小鼠CyclinD1、PCNA單克隆抗體(美國(guó)abcam公司)，兔抗小鼠Bax多克隆抗體、兔抗小鼠Bcl－2多克隆抗體、辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，兔抗小鼠β－actin多克隆抗體(上海生工生物工程股份有限公司)。

細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國(guó)Forma公司)，LightCycler96全自動(dòng)熒光定量PCR儀(瑞士Roche公司)，SDSPAGE電泳儀(Bio－Rad公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 S180 小鼠移植瘤模型的建立

取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的S180細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至5×106cells/mL，無(wú)菌條件下(按 0.2mL/只)給予Balb/c小鼠腹腔注射。7 d后抽取腹水，用0.9%氯化鈉溶液洗滌細(xì)胞3次，并調(diào)整細(xì)胞濃度至2×107cells/mL，按每只 0.2 mL 接種于健康的Balb/c小鼠右前肢腋部皮下，建立小鼠S180移植瘤模型。

1.2.2 分組及處理

建模后次日，將40只S180荷瘤鼠隨機(jī)分為5組:對(duì)照組，CTX 組，AKCP 高(AKCP－H)、中(AKCP－M)、低(AKCP－L)劑量組，每組 8 只。對(duì)照組每日給予蒸餾水0.5 mL灌胃;CTX組每日給予20 mg·kg－1的 CTX 腹腔注射;AKCP－H、－M、－L 組每日分別按 200、100、50 mg·kg－1濃度給予 AKCP溶液0.5 mL灌胃(本研究組按文獻(xiàn)［3］提取 AKCP，得到凍干粉劑，用苯酚硫酸法測(cè)得總糖含量為52%，實(shí)驗(yàn)用AKCP以蒸餾水溶解)。

上述各組小鼠連續(xù)給藥10 d后處死，無(wú)菌條件下剝?nèi)∧[瘤實(shí)體，去除血污，稱(chēng)取瘤重，計(jì)算抑瘤率［(對(duì)照組平均瘤質(zhì)量－給藥組平均瘤質(zhì)量)/對(duì)照組平均瘤質(zhì)量×100%］。

1.2.3 S180實(shí)體瘤組織病理學(xué)的觀察

切取部分瘤組織經(jīng)10%福爾馬林固定24 h，常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋、切片后，進(jìn)行HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察瘤組織形態(tài)。

1.2.4 瘤組織 PCNA、CyclinD1、Ki67、Bcl－2 以及Bax mRNA的表達(dá)檢測(cè)

用熒光定量法檢測(cè)。取100 mg左右瘤組織，用Trizol法提取總 RNA，按 GoScriptTM Reverse Transcription System試劑盒說(shuō)明書(shū)反轉(zhuǎn)錄成cDNA，按SuperReal PreMix Plus(SYBR Green)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性900 s，95℃變性10 s，60℃退火30 s，60℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)。以β－actin作為內(nèi)參基因，以模型組為對(duì)照組，參照文獻(xiàn)［4］計(jì)算各因子mRNA相對(duì)表達(dá)量。

應(yīng)用Primer 5.0設(shè)計(jì)引物，交由上海生工生物工程股份有限公司合成，上下游引物序列見(jiàn)表1。

1.2.5 瘤組織 PCNA、CyclinD1、Bcl－2 以及 Bax 蛋白的表達(dá)檢測(cè)

用Western blot法檢測(cè)。冷凍的瘤組織加入預(yù)冷的組織裂解液，研磨裂解，離心收集上清，用BCA法測(cè)定蛋白濃度。以30μg蛋白樣品上樣、SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳后，采用濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)至PVDF膜。用5%脫脂奶粉封閉，加入 β－actin(1:2000)、CyclinD1(1:10000)、PCNA(1:10000)、Bcl－ 2(1:1000)和Bax(1:1000)等一抗，4℃過(guò)夜孵育，用PBST洗膜后，加入HRP標(biāo)記的二抗，室溫孵育2 h，加入ECL化學(xué)發(fā)光液，置于凝膠成像儀拍照，以Image J軟件測(cè)定目的蛋白和內(nèi)參蛋白條帶的灰度值，計(jì)算目的蛋白與內(nèi)參蛋白的灰度比。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(珋x±s)表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

表1 熒光定量PCR引物序列Table 1 Sequences of Primers for quantitative real time PCR

2 結(jié)果

2.1 AKCP對(duì)S180荷瘤鼠腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用

AKCP－L組瘤體質(zhì)量低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)(圖 1，表 2)。

結(jié)果顯示，CTX 組及 AKCP－H、AKCP－M、

圖1 各組S180實(shí)體瘤形態(tài)圖Figure 1 Image of morphology of sarcoma 180 solid tumor in each group

表2 AKCP對(duì)S180荷瘤小鼠瘤重的影響(n=8，±s)Table 2 Effect of AKCP on tumor weight of sarcoma 180 tumor－bearing mice(n=8，±s)

表2 AKCP對(duì)S180荷瘤小鼠瘤重的影響(n=8，±s)Table 2 Effect of AKCP on tumor weight of sarcoma 180 tumor－bearing mice(n=8，±s)

*:與對(duì)照組比較，P＜0.05.*:Compare with control group，P＜0.05.

組別Group劑量Does(mg/kg)瘤質(zhì)量Tumor weight(g)抑瘤率Antitumor rate(%)對(duì)照組 Control － 0.915±0.251 －環(huán)磷酰胺 CTX 20 0.384±0.098* 58.033 AKCP 高劑量 AKCP－H 200 0.681±0.189* 25.574 AKCP 中劑量 AKCP－M 100 0.624±0.199* 31.803 AKCP 低劑量 AKCP－L 50 0.702±0.256* 23.279 F 6.766 P ＜0.001

2.2 AKCP對(duì)S180實(shí)體瘤組織病理學(xué)表現(xiàn)的影響

經(jīng)HE染色，在光鏡下觀察，對(duì)照組瘤細(xì)胞形態(tài)及大小各異，核大深染，細(xì)胞數(shù)量多且排列密集;CTX組及AKCP各劑量組腫瘤組織出現(xiàn)不同程度壞死區(qū)，瘤細(xì)胞數(shù)量減少，排列稀疏，間質(zhì)增多及白細(xì)胞浸潤(rùn)(圖2)。

圖2 AKCP對(duì)S180實(shí)體瘤組織病理形態(tài)的影響圖(HE，×100)Figure 2 Effect of AKCP on pathological morphology of sarcoma 180 solid tumor tissue(HE，×100)

2.3 AKCP 對(duì)瘤組織 CyclinD1、PCNA、Ki67、Bcl－2以及Bax mRNA表達(dá)的影響

用2－△△Ct法計(jì)算瘤組織中各因子mRNA相對(duì)表達(dá)量。CTX組、AKCP－H、AKCP－M、AKCP－L組的CyclinD1、PCNA、Ki67、Bcl－ 2、Bax、Bcl－ 2/Bax mRNA表達(dá)量與對(duì)照組比較均無(wú)明顯差異(P＞0.05)(表3)。

表 3 AKCP 對(duì)瘤組織中 CyclinD1、PCNA、Ki67、Bcl－2 和 Bax mRNA 相對(duì)表達(dá)及 Bcl－2/Bax 比值的影響結(jié)果(n=8，±s)Table 3 Effect of AKCP on the expression of CyclinD1，PCNA，Ki67，Bcl－2 and the relative expression of Bax mRNA and Bcl－2/Bax ratio in tumor tissue(n=8，±s)

表 3 AKCP 對(duì)瘤組織中 CyclinD1、PCNA、Ki67、Bcl－2 和 Bax mRNA 相對(duì)表達(dá)及 Bcl－2/Bax 比值的影響結(jié)果(n=8，±s)Table 3 Effect of AKCP on the expression of CyclinD1，PCNA，Ki67，Bcl－2 and the relative expression of Bax mRNA and Bcl－2/Bax ratio in tumor tissue(n=8，±s)

F 0.079 0.271 1.473 0.865 0.352 1.243 P 0.988 0.895 0.231 0.495 0.841 0.311

2.4 AKCP 對(duì)瘤組織中 CyclinD1、PCNA、Bcl－2 以及Bax蛋白表達(dá)的影響

用 Western blot法檢測(cè) CyclinD1、PCNA、Bcl－2以及Bax在各組中的表達(dá)(圖3)，以上述因子的蛋白條帶灰度與內(nèi)參蛋白(β－actin)條帶灰度的比值，作為各因子的相對(duì)蛋白表達(dá)量。結(jié)果顯示，CTX組及AKCP－H、AKCP－M、AKCP－L組中上述各因子蛋白表達(dá)水平以及Bcl－2/Bax蛋白表達(dá)水平比值與對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)(表4)。

圖3 各組瘤組織中β－actin、CyclinD1、PCNA、Bcl－2和Bax蛋白表達(dá)圖Figure 3 Image of the protein expression ofβ－actin，CyclinD1，PCNA，Bcl－2 and Bax in tumor tissue in each group

表4 AKCP對(duì)瘤組織中 CyclinD1、PCNA、Bcl－2和 Bax蛋白表達(dá)及 Bcl－2/Bax比值的影響結(jié)果 (n=8，±s)Table 4 Effect of AKCP on the protein expression of CyclinD1，PCNA，Bcl－2，Bax and the Bcl－2/Bax ratio in tumor tissue(n=8，±s)

表4 AKCP對(duì)瘤組織中 CyclinD1、PCNA、Bcl－2和 Bax蛋白表達(dá)及 Bcl－2/Bax比值的影響結(jié)果 (n=8，±s)Table 4 Effect of AKCP on the protein expression of CyclinD1，PCNA，Bcl－2，Bax and the Bcl－2/Bax ratio in tumor tissue(n=8，±s)

組別 Group CyclinD1/β－actin PCNA/β－actin Bcl－2/β－actin Bax/β－actin Bcl－2/Bax對(duì)照組 Control 0.802±0.467 0.903±0.245 1.365±0.806 1.033±0.513 1.005±0.780環(huán)磷酰胺 CTX 0.453±0.415 0.911±0.489 1.259±0.726 1.473±0.860 1.450±2.336 AKCP 高劑量 AKCP－H 1.250±1.250 1.022±0.444 1.929±0.836 1.350±0.612 0.588±0.294 AKCP 中劑量 AKCP－M 1.286±1.550 1.550±2.145 1.801±1.548 1.634±0.994 0.902±0.584 AKCP 低劑量 AKCP－L 0.864±0.286 0.877±0.336 1.090±0.697 1.039±0.460 1.439±1.469 F 1.077 0.617 1.090 1.099 0.631 P 0.383 0.654 0.377 0.373 0.643

3 討論

多糖(polysaccharides)是由十個(gè)以上的單糖通過(guò)糖苷鍵結(jié)合形成的高分子聚合物，廣泛存在于自然界動(dòng)植物中。近年來(lái)，多糖具有的低毒性的抗腫瘤作用日益被研究者重視。本研究顯示，AKCP對(duì)S180荷瘤鼠腫瘤生長(zhǎng)具有較明顯的抑制作用，高、中、低劑量組抑瘤率分別為 25.574%、31.803%和23.279%。這與本課題組之前進(jìn)行的雪靈芝水溶性提取物對(duì)H－22荷瘤鼠腫瘤生長(zhǎng)具有抑制作用［2］的研究結(jié)果一致。

目前研究表明［5－6］，多糖可通過(guò)兩個(gè)途徑發(fā)揮抗腫瘤作用:其一為直接作用，即多糖通過(guò)調(diào)控細(xì)胞增殖與凋亡相關(guān)因子的表達(dá)，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡，發(fā)揮直接的抗腫瘤作用;其二為間接作用，即多糖通過(guò)激活機(jī)體抗腫瘤免疫細(xì)胞和因子，殺傷腫瘤組織，間接地發(fā)揮抗腫瘤作用。為了解AKCP是否是以直接抑制途徑發(fā)揮對(duì)S180荷瘤鼠的抗腫瘤效應(yīng)，本研究對(duì)瘤組織中與細(xì)胞增殖及凋亡相關(guān)因子的mRNA和蛋白表達(dá)水平進(jìn)行了測(cè)定。在細(xì)胞增殖相關(guān)因子方面，CyclinD1作為細(xì)胞周期正性調(diào)節(jié)蛋白，通過(guò)調(diào)節(jié)CDK活性，加速細(xì)胞從 G1期進(jìn)入 S期，在腫瘤組織中高表達(dá)［7］;PCNA作為增殖細(xì)胞核抗原，調(diào)節(jié)DNA多聚酶活性，對(duì)DNA復(fù)制起著重要作用，在增殖細(xì)胞中高表達(dá)［8］;Ki67是增殖性細(xì)胞標(biāo)記物，在除G0期外的所有細(xì)胞周期中表達(dá)，也是反映細(xì)胞增殖水平的指標(biāo)［9］。本研究觀察了上述3個(gè)因子表達(dá)水平，結(jié)果顯示，在AKCP高、中、低劑量組中，CyclinD1、PCNA和Ki67的mRNA表達(dá)水平，以及CyclinD1與PCNA蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組接近，差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示AKCP不是通過(guò)直接作用途徑抑制腫瘤細(xì)胞增殖。

在凋亡相關(guān)因子方面，Bcl－2基因家族中的抑凋亡基因Bcl－2、促凋亡基因Bax對(duì)細(xì)胞凋亡發(fā)揮重要的調(diào)控作用，二者表達(dá)量的比率，決定它們傾向于形成Bcl－2/Bax異源二聚體抑制細(xì)胞凋亡，還是傾向于形成Bax/Bax同源二聚體促進(jìn)細(xì)胞凋亡［10］。熒光定量PCR與Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，AKCP各劑量組Bcl－2和Bax的mRNA及蛋白表達(dá)水平均略低于或高于對(duì)照組，且差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而AKCP各劑量組Bcl－2/Bax mRNA及蛋白表達(dá)量的比值與對(duì)照組比較，有降低的趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。此結(jié)果尚不能定論AKCP是否有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用，有待通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。

綜合上述結(jié)果，本文從體內(nèi)研究的角度，證實(shí)了AKCP具有明顯的抑制S180荷瘤小鼠瘤體生長(zhǎng)的效應(yīng)，為今后探索雪靈芝這一寶貴的高原植物的藥用價(jià)值提供了依據(jù)。然而，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)雖能綜合地反映藥物的整體效應(yīng)，但用于細(xì)胞、分子水平的機(jī)制研究，受一些干擾因素的限制，如瘤體間質(zhì)中存在不同程度增生的成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞和浸潤(rùn)的免疫細(xì)胞，以及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的個(gè)體間差異等。因此，對(duì)AKCP抗腫瘤機(jī)制的探究，一方面有待進(jìn)一步開(kāi)展體外實(shí)驗(yàn)，觀察AKCP對(duì)體外培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞增殖的影響，在直接性抑瘤作用途徑方面對(duì)本研究結(jié)果進(jìn)行補(bǔ)充、驗(yàn)證;另一方面，需要在本研究組前期研究所顯示的AKCP具有較強(qiáng)的免疫激活作用基礎(chǔ)上［11，12］，觀察 AKCP 對(duì) S180 荷瘤小鼠免疫細(xì)胞、免疫因子活化水平的影響。