張 霞，衛(wèi)福磊，張 婭，朱世海，栗瑞紅，王玉晴，吳 君，馬 睿，金文杰，韓步鷹，千康康，申志新，關(guān)宏弢，李長(zhǎng)忠*

(1.青海大學(xué)生態(tài)環(huán)境工程學(xué)院，青海西寧，810016;2.青海省漁業(yè)環(huán)境監(jiān)測(cè)站，青海 西寧，810012)

實(shí)現(xiàn)水體污染提前預(yù)警是當(dāng)前生物學(xué)研究的熱點(diǎn)，其研究難點(diǎn)在于生物標(biāo)記物的篩選。本研究以高原花斑裸鯉為研究對(duì)象，擬通過(guò)對(duì)高原花斑裸鯉Cu/Zn－SOD基因的克隆鑒定表達(dá)及對(duì)其Cu2+脅迫的應(yīng)答分析，篩選重金屬脅迫下的生物標(biāo)記物。

銅(Cu)既是魚(yú)類生命活動(dòng)所必需的微量元素，又是水生環(huán)境中最普遍的污染物之一。然而，Cu作為一種生物體所必需的微量元素與作為一種致毒金屬之間的濃度范圍極其狹窄［1－3］，即使在低濃度下，Cu可以引起魚(yú)、蟹和蝦等的免疫毒性，導(dǎo)致食用者嚴(yán)重的健康風(fēng)險(xiǎn)［4］。SOD作為一類抗氧化物酶類，將超氧陰離子自由基轉(zhuǎn)化為過(guò)氧化氫(Hydrogen peroxide，H2O2)，清除機(jī)體內(nèi)的氧自由基。在抗氧化系統(tǒng)中，SOD被認(rèn)為是抗氧化應(yīng)激的第一道防線［5］。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)［6］，SOD 可以作為一種生物標(biāo)志物(biomarker)或生理生化指標(biāo)應(yīng)用于分子生態(tài)毒理研究中。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處理

花斑裸鯉:3齡期成體花斑裸鯉(n=20)獲取于青海省漁業(yè)環(huán)境監(jiān)測(cè)站隆務(wù)河口養(yǎng)殖場(chǎng)，體重為105±10 g，體長(zhǎng)為19±3 cm。暫養(yǎng)于青海大學(xué)生態(tài)環(huán)境工程學(xué)院細(xì)胞遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)室冷流水養(yǎng)殖箱(溫度17℃±2℃;光照周期14h/10h)。適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)環(huán)境一周后，進(jìn)行Cu2+脅迫。實(shí)驗(yàn)用水為曝氣2 d的自來(lái)水，實(shí)驗(yàn)期間，用增氧泵自動(dòng)充氧，全程溶氧量不低于6 mg/L。另外，為避免實(shí)驗(yàn)動(dòng)物饑餓對(duì)實(shí)驗(yàn)造成影響，實(shí)驗(yàn)期間正常喂食，每天換三分之一的水以保持水體清潔，并增加相應(yīng)量的Cu2+以維持Cu2+濃度平衡。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑選擇

用1000 mL ddH2O溶解15.6 mg的分析純級(jí)五水硫酸銅(CuSO4·5H2O)，配成濃度為4 mg/L的Cu2+母液，每次使用時(shí)稀釋成濃度為0.01 mg/L的Cu2+。

1.3 Cu2+脅迫

隨機(jī)選取大小一致、健康的花斑裸鯉20尾，分別投入到空白對(duì)照組(5尾)和1個(gè)處理組(3個(gè)水族箱內(nèi)各5尾)，在3個(gè)時(shí)間段分別取樣3尾。處理組脅迫濃度以《中國(guó)漁業(yè)水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)》(GB 11607－1989)中Cu2+的標(biāo)準(zhǔn)值(0.01mg/L)為試驗(yàn)濃度。

1.4 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)虹鱒魚(yú)(Oncorhynchus mykiss)、鯉魚(yú)(C.carpio)、斑馬魚(yú)(Danio rerio)、鯽魚(yú)(C.auratus)等已知Cu/Zn－SOD cDNA保守序列，利用Primer Premier 5.0(Premier，Canada)設(shè)計(jì)用于 PCR 擴(kuò)增的引物(表1)。

表1 PCR引物相關(guān)參數(shù)Table 1 Reference of the Oligo nucleotide primers used for PCR

續(xù)表:

1.5 RNA提取與cDNA合成

對(duì)照組和脅迫后12、24、48 h的處理組分別隨機(jī)取樣3尾魚(yú)，用干毛巾擦干魚(yú)體，采集肝、腎、腦、鰓組織，立即用液氮速凍，然后放入－80℃冰箱中保存。

利用TIANGEN RNAsimple Total RNA Kit試劑盒(DP419，天根，中國(guó))提取花斑裸鯉肝、腎、腦、鰓組織總RNA，－80℃保存。采用PrimeScriptTM 1st strand cDNA Synthesis Kit逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(AK3902，TaKaRa，日本)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

1.6 Cu/Zn－SOD 全長(zhǎng) cDNA 克隆

以1.5反轉(zhuǎn)的鰓組織的cDNA為模板，用引物Cu/Zn－SODF1/Cu/Zn－SODR1(表 1)進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，獲得花斑裸鯉Cu/Zn－SOD特異性片段。采用RACE技術(shù)擴(kuò)增 Cu/Zn－SOD 5'端非編碼區(qū)(5'－UTR)和 3'端非編碼區(qū)(3'－UTR)。3'RACE和 5'RACE分別使用引物Cu/Zn－SODS1/Cu/Zn－SODS2和Cu/Zn－SODA1/Cu/Zn－SODA2(表 1)進(jìn)行擴(kuò)增。最后利用引物 Cu/Zn－SODCPF1/Cu/Zn－SODCPR1(表1)進(jìn)行Confirm PCR擴(kuò)增。

1.7 Cu/Zn－SOD序列分析及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建

使用DNAman軟件進(jìn)行DNA全長(zhǎng)拼接并翻譯成氨基酸序列。用ProtParam軟件對(duì)推導(dǎo)出的蛋白序列進(jìn)行蛋白理化特性預(yù)測(cè)分析(http://web.expasy.org/protparam)。運(yùn)用生物信息學(xué)軟件 Vector NTI(Infor－Max，F(xiàn)rederick，USA)進(jìn)行同源性比較，采用軟件 MEGA 7構(gòu)建鄰接(Neighbor－joining，NJ)系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.8 Cu2+脅迫下Cu/Zn－SOD的表達(dá)量檢測(cè)

使用引物 Cu/Zn－SODRTF1/Cu/Zn－SODRTR1(表1)，以β－actin為內(nèi)參進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 Cu/Zn－SOD 克隆

通過(guò)RT－PCR和RACE技術(shù)獲得Cu/Zn－SOD全長(zhǎng)cDNA序列(共785bp)，包含210 bp的片段序列(圖1A)、277 bp的 3'－UTR(圖 1B)和 43 bp的5'－UTR(圖 1C)，最后進(jìn)行 Confirm PCR 鑒定(圖1D)。GenBank登錄號(hào):KX826080。

圖1 花斑裸鯉Cu/Zn－SOD PCR產(chǎn)物電泳圖Figure 1 PCR products of GeCu/Zn－SOD

2.2 Cu/Zn－SOD 序列特征分析

花斑裸鯉 Cu/Zn－SOD的全長(zhǎng) cDNA序列共785 bp，被命名為GeCu/Zn－SOD(GenBank序列號(hào):KX826080)，由465 bp的編碼區(qū)、43 bp的 5'－UTR和277 bp的3'－UTR構(gòu)成。Cu/Zn－SOD共編碼了154個(gè)氨基酸，分子量為15.62 KDa，等電點(diǎn)(Isoelec-tric point，PI)為 6.02。Cu/Zn－SOD 的氨基酸序列中含有3個(gè)O－糖基化位點(diǎn)、4個(gè)N－糖基化位點(diǎn)、5個(gè)磷酸化作用位點(diǎn)(4個(gè)絲氨酸和1個(gè)蘇氨酸)、7個(gè)重金屬結(jié)合位點(diǎn)(3個(gè)Zn2+結(jié)合位點(diǎn)，3個(gè)Cu2+結(jié)合位點(diǎn)，1個(gè)Cu2+和Zn2+共同的結(jié)合位點(diǎn))、2個(gè)半胱氨酸位點(diǎn)C58和C147及2個(gè)Cu/Zn－SOD家族標(biāo)簽序列(45－GFHVHAFGDNT－55，139－GNAGGRLACGVI－150)。3'－UTR 含有 10個(gè)多聚腺苷酸尾巴和1個(gè)3'端的加尾信號(hào)，無(wú)信號(hào)肽和跨膜區(qū)。Cu/Zn－SOD二級(jí)結(jié)構(gòu)無(wú)α－螺旋和β－折疊，其中延伸鏈占 44.8%，環(huán)占 55.2%(圖 2)。

圖2 花斑裸鯉Cu/Zn－SOD cDNA序列和氨基酸序列圖Figure 2 The full length cDNA sequences and amino acid sequences of Cu/Zn－SOD

2.3 Cu/Zn－SOD 鄰接樹(shù)構(gòu)建

根據(jù)20個(gè)物種的Cu/Zn－SOD的氨基酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(圖3)和同源性分析(表2)結(jié)果表明，該進(jìn)化樹(shù)分為5簇:硬骨魚(yú)類、哺乳類、兩棲類、細(xì)菌類和軟體類，而花斑裸鯉屬硬骨魚(yú)類一簇，這與傳統(tǒng)分類結(jié)果一致。GeCu/Zn－SOD氨基酸序列與其他物種中該序列的同源性為硬骨魚(yú)類81%～94%、哺乳類78%～74%、軟體類75%、兩棲類74%～75%和細(xì)菌類23%～24%。

圖3 Cu/Zn－SOD進(jìn)化樹(shù)Figure 3 Phylogenetic tree of the Cu/Zn－SOD

表2 花斑裸鯉與其他物種Cu/Zn－SOD氨基酸序列同源性分析結(jié)果Table 2 Homology analysis of the Cu/Zn－SOD amino acid sequences between G.eckloni and other species

2.4 GeCu/Zn－SOD在各組織中的表達(dá)檢測(cè)

用Real－time PCR法檢測(cè)GeCu/Zn－SOD在肝、腎、腦、鰓組織中的表達(dá)，肝中的表達(dá)量最高，是鰓表達(dá)量的 11.4 倍(n=3，P＜0.05);其次為腎和腦，分別是鰓相對(duì)表達(dá)量的 2.9 倍和 1.6 倍(n=3，P＜0.05)圖4)。

圖4 GeCu/Zn－SOD基因在花斑裸鯉各組織中的表達(dá)分析圖Figure 4 Expression analysis of GeCu/Zn－SOD in tissues of G.eckloni

2.5 Cu2+脅迫下 GeCu/Zn－SOD 應(yīng)答檢測(cè)

用Real－time PCR技術(shù)檢測(cè)Cu2+脅迫下花斑裸鯉GeCu/Zn－SOD在肝、腎、腦、鰓組織的應(yīng)答(圖5)。在Cu2+脅迫下，GeCu/Zn－SOD在肝中脅迫后12 h下降，到24 h時(shí)表達(dá)量升高到最大值，而后下降(P＜0.05);在腎中脅迫后12 h下降后，一直升高到48 h達(dá)到最高(P＜0.05);在腦中脅迫后48 h內(nèi)的表達(dá)量基本不變(P＞0.05);在鰓中脅迫后到24 h時(shí)表達(dá)量升高到最大值，而后下降(P＜0.05)。

圖5 GeCu/Zn－SOD基因在花斑裸鯉肝、腎、腦和鰓組織中的表達(dá)分析圖Figure 5 Expression analysis of GeCu/Zn－SOD in liver，kidney，brain and gill tissues of G.eckloni

3 討論

序列特征分析表明，GeCu/Zn－SOD氨基酸序列同鯉魚(yú)、鯽魚(yú)和斑馬魚(yú)的Cu/Zn－SOD氨基酸序列高度相似。GeCu/Zn－SOD與其他物種Cu/Zn－SOD氨基酸序列同源性比對(duì)結(jié)果顯示:花斑裸鯉同硬骨魚(yú)的同源性都較高，其中花斑裸鯉與鯉魚(yú)的同源性高達(dá)94%，表明了Cu/Zn－SOD在進(jìn)化上的高度保守性。

在Cu2+脅迫下，花斑裸鯉的肝、腎、腦、鰓組織中GeCu/Zn－SOD在mRNA水平相對(duì)表達(dá)量呈現(xiàn)出一定的規(guī)律性。GeCu/Zn－SOD在不同的組織中有著不同的表達(dá)模式，基本上是在脅迫后24 h或48 h達(dá)到最高值(P＜0.05)。這與以往研究結(jié)果基本一致［7，8，9－10］。主要原因可能是，Cu2+的脅迫產(chǎn)生了大量的活性氧簇(Reactive Oxygen Species，ROS)，ROS作為一種信號(hào)分子激活了Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白 1(Kelch－like ECH associatedprotein 1，Keap1)－核因子E2相關(guān)因子2(NF－E2 p45－related factor 2，Nrf2)－抗氧化反應(yīng)元件(Antioxidant Response Element，ARE)信號(hào)通路，Keap1－Nrf2－ARE 信號(hào)通路的激活又促使 Nrf2激活，促進(jìn)下游靶基因Cu/Zn－SOD等的表達(dá)，提高機(jī)體抗氧化能力［11］。因此，在Cu2+脅迫下，花斑裸鯉Cu/Zn－SOD在mRNA水平上會(huì)產(chǎn)生氧化應(yīng)激應(yīng)答。

綜上所述，氧化應(yīng)激是一個(gè)涉及多條信號(hào)通路及相關(guān)基因和蛋白的復(fù)雜的毒理過(guò)程，是多條通路共同作用的結(jié)果［12］。花斑裸鯉在Cu2+脅迫下SOD在不同組織應(yīng)答模式的調(diào)控機(jī)理還需要進(jìn)一步研究。本研究成功實(shí)現(xiàn)高原花斑裸鯉Cu/Zn－SOD的克隆鑒定表達(dá)，初步得到了花斑裸鯉Cu/Zn－SOD對(duì)Cu2+脅迫的應(yīng)答模式，有助于揭示Cu/Zn－SOD的抗氧化生理機(jī)制以及污染水體生物標(biāo)記物的篩選，為天然水域環(huán)境質(zhì)量評(píng)價(jià)提供敏感、快速、易于掌握的評(píng)價(jià)手段。