劉子寧，陳 凡，殷 麟，馮瑞興，蔡俊濤，林 晶，李 鵬

(1.青海大學醫(yī)學院;2.青海大學附屬醫(yī)院;青海 西寧810001)

放射性心臟損傷(Radiation－induced heart disease，RIHD)早期常因無明顯臨床癥狀而易被忽視，晚期則會發(fā)生不可逆的心功能減退甚至猝死等嚴重的并發(fā)癥。放射治療引起的心血管疾病造成的死亡率僅次于腫瘤本身復發(fā)及轉(zhuǎn)移所導致的死亡［1］。

線粒體組織對輻射敏感。心肌細胞中含有大量的線粒體，輻射會造成其形態(tài)學上的改變及持續(xù)的功能改變，激活細胞的線粒體凋亡途徑［2］。RIHD晚期損傷的發(fā)生與心肌細胞凋亡水平的增高有著重要的關(guān)系。Bcl－2家族是線粒體凋亡信號轉(zhuǎn)導途徑中關(guān)鍵的凋亡調(diào)節(jié)因子［3］:Bcl－2可增加谷胱甘肽的表達，改變細胞的氧化還原平衡降低半胱天冬酶的活性，從而抑制細胞凋亡;Bax可與Bcl－2生成異源二聚體使Bcl－2失活，從而促進細胞的凋亡。細胞的凋亡水平與細胞內(nèi)Bcl－2/Bax表達比率關(guān)系密切［4］。

紅景天苷是紅景天的主要成分之一，其具有保護缺血再灌注小鼠模型心肌組織，減輕心臟損傷的作用;并能降低慢性心衰大鼠模型心肌細胞凋亡水平。［5－6］RIHD 尚缺乏有效的防治方法，本研究擬通過建立RIHD小鼠模型探討紅景天苷對RIHD的保護作用及可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選取4周齡SPF級昆明小鼠75只［動物合格證號:SCXX(軍)2013－14］，雌雄各半，體重 20±2 g，隨機分為5組:空白組(16只)、10 Gy組(16只)、10 Gy+干預組(16只)、20 Gy組(16只)、20 Gy+干預組(16只)，適應性喂養(yǎng)一周，雌雄分籠飼養(yǎng)。

1.2 主要儀器與試劑

23EX醫(yī)用直線加速器(美國瓦里安公司)，酶標儀9602(北京朗普提科技公司)，紅景天苷(上海哈靈生物科技有限公司，純度:98%)，小鼠B細胞淋巴瘤因子2(Bcl－2)抗體、小鼠Bcl2關(guān)聯(lián)X蛋白(Bax)抗體(武漢博士德公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 RIHD 小鼠模型建立

小鼠在照射前5 min前稱重，腹腔注射0.5%戊巴比妥0.2 mL進行麻醉，麻醉后固定四肢，置于醫(yī)用直線加速器治療床上，激光定位于心臟部，設(shè)置1 cm×1 cm照射野，源皮距100 cm，劑量率3 Gy/min。照射后等小鼠自然蘇醒放回原處飼養(yǎng)，并記錄小鼠照射后的一般情況。

1.3.2 紅景天苷干預

小鼠照射后對干預組小鼠給予紅景天苷［50mg/(kg·d)］灌胃給藥，對照組和單純照射組給予相同體積蒸餾水灌胃，持續(xù)7 d。

1.3.3 取材

分別于照射后1、2、4 w稱重后以頸部脫臼法處死小鼠，開胸取出小鼠心臟組織放入－80℃冰箱低溫保存。

1.3.4 Bcl－2、Bax 的表達檢測

用蛋白質(zhì)印跡法(Western Blot，WB)檢測Bcl－2、Bax的表達。取少量心臟組織加入裂解液勻漿，離心(4℃，10000g，2min)取上清液，依次經(jīng)過制膠及上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后，加入一抗抗體(Bax為1:1000，Bcl－2 為1:1000)，孵育過夜(4℃)，TTBS洗膜，振蕩(37℃，60min，加入辣根過氧化物酶標記的二抗，Bax為 1:2000，Bcl－2 為 1:2000)。TTBS 再洗膜后置ECL混合液中溫育(5min)，然后曝光、顯影、定影，掃描，分析蛋白圖像。

1.4 統(tǒng)計學方法

使用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)均采用珋x±s表示，組間比較采用方差分析，兩兩比較用LSD 法。檢驗水準:α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 一般狀況的觀察

各小組小鼠均未出現(xiàn)死亡情況。對照組小鼠進食飲水量、活動度未發(fā)現(xiàn)明顯變化，體重隨時間逐漸增加。20 Gy組與20 Gy+干預組照射后一周與對照組相比較體重變化有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，10 Gy組與10 Gy+干預組與對照組相比較無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);第二周各實驗組小鼠進食飲水量明顯減少，活動度明顯減弱，各實驗組體重變化與對照組相比均有統(tǒng)計學差異(P＜0.05);隨著時間的延長各實驗組小鼠的進食飲水量逐漸恢復，第四周體重較本組第二周時有明顯的增長，20 Gy組與對照組仍有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)，其他實驗組與對照組相比較無統(tǒng)計學差異。紅景天苷干預組與同等照射劑量的單純照射組比較，干預組體重略高于單純照射組，照射后4周20 Gy+干預組與20 Gy組體重相比較有統(tǒng)計學差異性(P＜0.05)。詳見表1。

表1 各組小鼠不同時間體重變化情況(±s，g)Table 1 Changes of each group’s weightat different time in mice(±s，g)

表1 各組小鼠不同時間體重變化情況(±s，g)Table 1 Changes of each group’s weightat different time in mice(±s，g)

*:與對照組比較P＜0.05;#:與相同照射劑量的單純照射組比較P＜0.05.

組別 n 照射前 1 w 2 w 4 w對照組 5 24.71±1.69 30.40±1.66 34.10±1.40 37.01±1.72 10 Gy 組 5 25.09±1.83 30.36±1.12 31.41±1.61* 36.59±1.59 20 Gy 組 5 24.93±1.91 27.47±1.13* 29.71±1.15* 32.49±1.56*10 Gy+干預組 5 24.98±1.65 30.38±1.43 32.66±1.53 36.22±2.15 20 Gy+干預組 5 25.63±1.61 27.80±1.13* 30.61±1.28* 35.67±1.65#F 0.195 6.393 7.265 5.352 P 0.938 0.002 0.001 0.004

2.2 紅景天苷對各組RIHD小鼠Bcl－2及Bax表達的影響

用WB法檢測發(fā)現(xiàn):各試驗組小鼠照射1 w后Bcl－2及Bax的變化最為明顯，隨著放射劑量的增加，Bcl－2表達逐漸減少，Bax的表達逐漸增多，且與對照組相比較有顯著統(tǒng)計學意義(P＜0.05);隨著時間的增加，各組小鼠Bax的表達逐漸降低，但與對照組相比仍有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。紅景天苷可以增加Bcl－2、減少Bax的表達，紅景天苷干預組與相同照射劑量的單純照射組相比，Bcl－2、Bax的表達均有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。見圖1、表2。

圖1 各組小鼠Bcl－2及Bax的表達情況(β－actin為內(nèi)參)Figure 1 Expression of Bcl－2 and Bax in mice of each group(β－actin as an inner control)

表 2 各組小鼠不同時間 Bcl－2、Bax 表達情況(±s)Table 2 Expression of Bcl－ 2 and Bax at different time in mice of each group( ±s)

表 2 各組小鼠不同時間 Bcl－2、Bax 表達情況(±s)Table 2 Expression of Bcl－ 2 and Bax at different time in mice of each group( ±s)

*:與對照組比較P＜0.05;#:與相同照射劑量的單純照射組比較P＜0.05.

Bcl－2/β－actin Bax/β－actin組別 n 1 w 2 w 4 w 1 w 2 w 4 w對照組 5 1.182±0.087 1.120±0.062 1.206±0.052 0.428±0.043 0.418±0.041 0.435±0.036 10 Gy 組 5 0.998±0.055* 1.021±0.068* 1.143±0.071 0.949±0.069* 0.858±0.051* 0.560±0.059*20 Gy 組 5 0.757±0.062* 0.817±0.062* 0.998±0.055* 1.412±0.067* 1.318±0.046* 1.007±0.088*10 Gy+干預組 5 1.116±0.069# 1.114±0.084# 1.121±0.044 0.781±0.046*# 0.679±0.041*# 0.468±0.045 20 Gy+干預組 5 0.831±0.029* 1.022±0.071*# 1.087±0.063*# 1.201±0.093*# 1.093±0.071*# 0.733±0.087*#F 42.210 19.682 11.618 164.865 228.681 61.753 P 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

2.3 紅景天苷對各組RIHD小鼠Bcl－2/Bax的影響

小鼠接受照射后Bcl－2/Bax的表達顯著降低，各實驗組與對照組、單純放射組與紅景天苷干預組之間比較差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。本研究結(jié)果顯示，紅景天苷可以顯著提高 RIHD小鼠Bcl－2/Bax的表達水平。見表4。

表3 各組小鼠不同時間Bcl－2/Bax表達情況(±s)Table 3 Expression of Bcl－ 2/Bax at different time in mice of each group( ±s)

表3 各組小鼠不同時間Bcl－2/Bax表達情況(±s)Table 3 Expression of Bcl－ 2/Bax at different time in mice of each group( ±s)

*:與對照組比較P＜0.05;#:與相同照射劑量的單純照射組比較P＜0.05.

組別 n 1 w 2 w 4 w F P對照組 5 2.799±0.502 2.867±0.352 2.790±0.315 0.055 0.947 10 Gy 組 5 1.054±0.076* 1.189±0.027* 2.051±0.177* 115.435 0.000 20 Gy 組 5 0.564±0.074* 0.620±0.033* 0.996±0.088* 70.384 0.000 10 Gy+干預組 5 1.430±0.082*# 1.648±0.201*# 2.601±0.253# 52.091 0.000 20 Gy+干預組 5 0.690±0.054*# 0.940±0.112*# 1.506±0.249*# 33.617 0.000 F 74.037 106.575 52.815 P 0.000 0.000 0.000

3 討論

RIHD是射線誘導的一種進行性加重的疾病，以前普遍認為心臟是放射耐受組織。近些年來有文獻報道心臟受到正常組織耐受劑量范圍之內(nèi)的輻射也會導致心臟損傷，特別是遲發(fā)型心肌損傷問題日益突出［7－8］。隨著放射各學科的快速發(fā)展以及科技水平的不斷進步，腫瘤放射治療的療效有了顯著的提高，且放療副反應有了明顯改善，然而由于解剖結(jié)構(gòu)的復雜性，RIHD的發(fā)生無法完全避免。近些年來RIHD越來越受到學界的重視。然而RIHD缺少有效的治療方法，只能預防，目前RIHD的治療與一般心肌病治療類似，給予休息、吸氧和鈣拮抗劑、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑、強心利尿劑治療等對癥處理(不能從本質(zhì)上解決RIHD的損害)。

急性RIHD的損傷常發(fā)生在放療后3個月以內(nèi)，常以進行性加重的非特異性炎癥損傷為主(如急性放射性心包炎、心肌炎等)，并會出現(xiàn)心肌酶的異常、心肌電生理的改變等，通常沒有明顯的臨床癥狀，不被醫(yī)生所重視;而慢性RIHD則發(fā)生在放射治療后的1年甚至數(shù)年后，常會發(fā)生嚴重的病變:由急慢性滲出性心包炎發(fā)展成縮窄性心包炎、放射性冠脈損傷、無癥狀的心功能減退等改變，嚴重者可能發(fā)生心力衰竭甚至猝死，偶有心臟瓣膜功能異常［9］。RIHD的發(fā)生與心肌心包組織的炎癥及纖維化、線粒體功能異常、毛細血管受損等密切相關(guān)［10］。本研究發(fā)現(xiàn)放射會引起心臟組織Bcl－2的表達降低及Bax的表達升高;引起B(yǎng)cl－2/Bax的表達顯著降低，且隨著放射劑量的增加升高更明顯(P＜0.05)。隨著時間的增加，各組Bcl－2的表達逐漸升高，Bax的表達逐漸降低，但Bcl－2/Bax的表達仍處于較低水平。Bcl－2/Bax持續(xù)低水平表達，會上調(diào)心肌細胞的凋亡水平。在正常的生理狀態(tài)下，心肌細胞屬于永久性細胞，凋亡水平持續(xù)增高會對心臟造成不可逆的損傷［11］。

對于RIHD高危人群或有心臟基礎(chǔ)疾病患者，盡早使用保護心血管藥物會減少或減輕RIHD的發(fā)生及危害程度。Van der Veen等［12］研究顯示，卡托普利能夠減輕放射線照射引起的小鼠心肌纖維化及心包積液，減輕急性RIHD癥狀而改善心臟功能。吳榮等［13］研究證實，氯沙坦能夠通過下調(diào)血管緊張素Ⅱ受體及核因子κB的表達來實現(xiàn)對大鼠RIHD的保護作用。放射治療期間給予抗炎藥物、抗氧化藥物同樣可以起到心臟保護作用。國內(nèi)亦有中藥預防 RIHD 的研究［14－15］:生脈注射液、丹紅注射液等可以顯著降低血清心肌酶、肌鈣蛋白的異常，對RIHD有一定防治作用。

紅景天苷是紅景天屬植物中廣泛存在的一種天然酚類次生代謝產(chǎn)物，可從植物根、莖提取，亦可通過生物化學合成途徑合成［16］。紅景天苷具有抗缺血缺氧、抗腫瘤等作用。紅景天苷可以提高小鼠在不同缺氧狀況下的生存能力，對缺氧有保護作用;減輕心肌細胞缺血再灌注損傷，降低乳酸脫氫酶和磷酸激酶的水平;降低慢性心衰大鼠模型心肌細胞Bcl－2/Bax的表達;誘導人類乳腺癌細胞模型中癌細胞周期阻滯和細胞凋亡［17－18］。本研究通過紅景天苷灌胃干預RIHD小鼠模型，發(fā)現(xiàn)紅景天苷可以上調(diào)Bcl－2、下調(diào)Bax的表達水平(P＜0.05)，從而降低心臟組織的凋亡水平，對心臟發(fā)揮保護作用。

我們通過建造不同劑量RIHD小鼠模型開展相關(guān)實驗研究，為紅景天苷防治RIHD的其他相關(guān)研究提供理論依據(jù)和實踐參考。本實驗亦存在一定的局限性:未設(shè)置紅景天苷濃度、時間梯度，還需進一步完善相關(guān)研究。