李潤(rùn)樂(lè)，李占強(qiáng)，廖夢(mèng)嬌，湯 鋒，楊全余#，格日力§

(1.青海大學(xué)高原醫(yī)學(xué)研究中心，青海西寧810001;2.青海大學(xué)高原人畜共患病研究所，青海 西寧810001;3.青海－猶他高原醫(yī)學(xué)聯(lián)合重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海西寧810001;4.青海大學(xué)附屬醫(yī)院肝膽胰外科，青海西寧810001)

泡型包蟲(chóng)病晚期病灶侵犯到門(mén)靜脈及轉(zhuǎn)移至腦部的多發(fā)性病人無(wú)法進(jìn)行手術(shù)治療，只能通過(guò)藥物抑制病灶發(fā)展［1］。現(xiàn)如今治療包蟲(chóng)病主要使用阿苯達(dá)唑，但該藥需要長(zhǎng)期高劑量服用，所以出現(xiàn)很多副作用(肝功能異常、血檢指標(biāo)異常等)［2，3］。因此尋找新的治療包蟲(chóng)病的藥物具有十分重要的意義。

杜鵑花科植物具有較強(qiáng)的殺蟲(chóng)作用，是否對(duì)多房棘球蚴有殺滅作用未見(jiàn)報(bào)道。烈香杜鵑(Rhododendron anthopogonoides Maxim)是藏藥達(dá)里主要成分之一，常用于治療慢性支氣管炎和冠心?。?－6］。本研究采用水蒸氣蒸餾法從烈香杜鵑葉中提取揮發(fā)油，在體外對(duì)多房棘球蚴進(jìn)行殺傷實(shí)驗(yàn)，通過(guò)掃描電鏡觀察其表面結(jié)構(gòu)，初步明確烈香杜鵑揮發(fā)油對(duì)多房棘球蚴的殺滅作用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器設(shè)備

烈香杜鵑葉(青海省大通縣，購(gòu)自青海藏藥材市場(chǎng))，DMEM(Gibico)，青霉素－鏈霉素混合溶液(Solarbio)，F(xiàn)BS(BI)，阿苯達(dá)唑(TCI，純度＞98%)，吡喹酮(Solarbio，純度＞98%)。

LSM 800激光共聚焦顯微鏡(Carl Zeiss Jena)，RE－3000B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)，DHG9070B鼓風(fēng)干燥箱(上海高致精密儀器有限公司)，BB15 型培養(yǎng)箱(Thermo)，Axio Vert.A1 型光學(xué)顯微鏡(Carl Zeiss Jena)。

1.2 方法

1.2.1 藥物提取

稱取50 g烈香杜鵑葉置于500 mL燒瓶，加入去離子水沒(méi)過(guò)藥材，浸泡過(guò)夜，采用水蒸氣連續(xù)加熱回流法蒸餾6 h，收集淡黃色揮發(fā)油3.2 mL，所得揮發(fā)油用無(wú)水Na2SO4干燥，備用。

1.2.2 原頭蚴的分離及體外培養(yǎng)

脫頸處死感染多房棘球蚴的沙鼠，無(wú)菌條件下分離沙鼠腹腔內(nèi)囊塊，在生理鹽水中剪碎，用45目尼龍網(wǎng)過(guò)濾，過(guò)濾后溶液使用300目尼龍網(wǎng)過(guò)濾，收集網(wǎng)上沉淀，用生理鹽水(含1%青霉素－鏈霉素)清洗沉淀。將沉淀置DMEM培養(yǎng)基(1%青霉素－鏈霉素，10%FBS)放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(37℃，5%CO2)。

1.2.3 藥物活性的檢測(cè)

烈香杜鵑揮發(fā)油用DMEM培養(yǎng)基稀釋至10 mg/mL，將2 mL稀釋液加入到激光共聚焦培養(yǎng)皿中，在玻底加入1 000個(gè)原頭蚴置活細(xì)胞工作站(37℃，5%CO2)培養(yǎng)，使用激光共聚焦顯微鏡動(dòng)態(tài)觀察。

取烈香杜鵑揮發(fā)油50 mg，使用DMEM培養(yǎng)基稀釋揮發(fā)油至10、5、1 mg/mL。將1 000個(gè)原頭蚴培養(yǎng)在6孔板中，每組三個(gè)復(fù)孔，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(37℃，5%CO2)。將阿苯達(dá)唑和吡喹酮分別用DMEM培養(yǎng)基稀釋至10 mg/mL，作為藥物對(duì)照。

用原頭蚴溶液和伊紅溶液1:1混合染色后置普通光鏡下觀察判斷。判斷標(biāo)準(zhǔn):死亡原頭蚴被伊紅染色成紅色且無(wú)活動(dòng)性，活原頭蚴未著色且具活動(dòng)性。吸取原頭蚴溶液10μL，計(jì)數(shù)原頭蚴著色數(shù)目，計(jì)數(shù)3次，死亡率(%)=(著色原頭蚴數(shù)量/原頭蚴總量)×100%。

1.2.4 原頭蚴掃描電鏡觀察

用3%戊二醛固定原頭蚴15 h、PBS清洗3次后用1%鋨酸固定1 h、PBS清洗3次、雙蒸水清洗2次后，依次用濃度為 50%、70%、80%、90%、100%、100%乙醇及叔丁醇脫水處理。最后將標(biāo)本于臨界點(diǎn)干燥、噴金、觀察。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用單因素方差分析，多重兩兩比較使用Dunnett－t檢驗(yàn)或LSD檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn) α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 烈香杜鵑揮發(fā)油對(duì)多房棘球蚴的殺滅作用

將1 000個(gè)原頭蚴加入到烈香杜鵑揮發(fā)油稀釋液中 (10mg/mL)，在活細(xì)胞工作站中實(shí)時(shí)觀察原頭蚴的變化。結(jié)果如圖1所示，在杜鵑揮發(fā)油的作用下，個(gè)別原頭蚴死亡 (黑色箭頭所示)，原頭蚴活性下降，運(yùn)動(dòng)減緩;阿苯達(dá)唑組在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)死亡原頭蚴，但原頭蚴活性較差，頭節(jié)外翻者較少;空白對(duì)照組中原頭蚴頭節(jié)均外翻，處于活躍狀態(tài)。

圖1 激光共聚焦顯微鏡下杜鵑揮發(fā)油對(duì)多房棘球蚴的殺傷效果圖Figure 1 Killing effect of Rhododendron anthopogonoides Maxim Oil on protoscoleces

2.2 烈香杜鵑揮發(fā)油對(duì)多房棘球蚴殺滅作用的藥效學(xué)評(píng)價(jià)

將含有10 mg/mL杜鵑揮發(fā)油、10 mg/mL阿苯達(dá)唑及10 mg/mL吡喹酮的培養(yǎng)基與原頭蚴共培養(yǎng)。0.75 h后用伊紅染色，光鏡下觀察發(fā)現(xiàn)10 mg/mL杜鵑揮發(fā)油組內(nèi)原頭蚴全部被伊紅染色，如圖2A所示;10 mg/mL阿苯達(dá)唑原頭蚴未被伊紅染色，如圖2B所示;10 mg/mL吡喹酮作用下，原頭蚴頭部變大，沒(méi)有被伊紅染色，如圖2C所示。空白對(duì)照組原頭蚴沒(méi)有被伊紅染色。經(jīng)藥物作用0.75 h后各組原頭蚴的死亡率見(jiàn)表1。

圖2 10 mg/mL杜鵑揮發(fā)油對(duì)原頭蚴的殺傷作用圖Figure 2 The effect of 10 mg/mL Rhododendron anthopogonoides Maxim Oil on protoscoleces

表1 10 mg/mL杜鵑揮發(fā)油與原頭蚴共培養(yǎng)0.75 h后死亡率(±s)Table 1 Mortality of protoscoleces after culture with 10mg/mL of Rhododendron anthopogonoide Maxim Oil 0.75 h( ±s)

表1 10 mg/mL杜鵑揮發(fā)油與原頭蚴共培養(yǎng)0.75 h后死亡率(±s)Table 1 Mortality of protoscoleces after culture with 10mg/mL of Rhododendron anthopogonoide Maxim Oil 0.75 h( ±s)

*:與對(duì)照組比較 P＜ 0.001;#:與阿苯達(dá)唑比較 P＜ 0.001;△:與吡喹酮比較 P＜ 0.001.

組別 n 死亡率(%)

將濃度為5、1 mg/mL杜鵑揮發(fā)油與原頭蚴體外培養(yǎng)12 h后，伊紅染色發(fā)現(xiàn)5 mg/mL杜鵑揮發(fā)油中原頭蚴大部分被伊紅染色，只有少數(shù)未染;1 mg/mL杜鵑揮發(fā)油中原頭蚴部分被伊紅染色，如圖3所示。經(jīng)不同濃度杜鵑揮發(fā)油作用12 h后各組原頭蚴死亡率見(jiàn)表2。

圖3 5 mg/mL和1 mg/mL杜鵑揮發(fā)油對(duì)原頭蚴的殺傷作用圖Figure 3 The effect of 5 mg/mL and 1 mg/mL of Rhododendron anthopogonoides Maxim Oil on protoscoleces

表2 5 mg/mL和1 mg/mL杜鵑揮發(fā)油與原頭蚴共培養(yǎng)12 h后死亡率(±s)Table 2 Mortality of protoscoleces after culture with 5 mg/mL and 1 mg/mL of Rhododendron anthopogonoide Maxim Oil 12 hours(±s)

表2 5 mg/mL和1 mg/mL杜鵑揮發(fā)油與原頭蚴共培養(yǎng)12 h后死亡率(±s)Table 2 Mortality of protoscoleces after culture with 5 mg/mL and 1 mg/mL of Rhododendron anthopogonoide Maxim Oil 12 hours(±s)

*:與對(duì)照組比較 P＜ 0.001.

組別 n 死亡率(%)對(duì)照組30.900±0.200 5 mg/mL 杜鵑揮發(fā)油組 3 80.000±2.000*1 mg/mL 杜鵑揮發(fā)油組 3 43.000±2.000*F 1376.692 P＜0.001

2.3 對(duì)杜鵑揮發(fā)油作用后原頭蚴的超微結(jié)構(gòu)觀察

多房棘球蚴用10 mg/mL杜鵑揮發(fā)油作用后立刻用3%戊二醛固定，做掃描電鏡檢查。結(jié)果如圖4所示，原頭蚴在杜鵑揮發(fā)油作用后體表微絨毛消失，體表凹凸不平，頭部損傷并且鉤脫落，而正常對(duì)照組原頭蚴體表微絨毛豐富，體表光滑完整。

圖4 杜鵑揮發(fā)油作用后原頭蚴的掃描電鏡結(jié)果圖Figure 4 Structural changes of the protoscoleces treated with Rhododendron anthopogonoides Maxim Oil

3 討論

阿苯達(dá)唑是臨床上用于治療包蟲(chóng)病的首選藥物，阿苯達(dá)唑作用于蟲(chóng)體延胡索酸還原酶系統(tǒng)，抑制三磷酸腺苷生成，從而使蟲(chóng)體無(wú)法生存和繁殖［7］。吡喹酮是常用的腸道寄生蟲(chóng)驅(qū)蟲(chóng)藥，專(zhuān)門(mén)治療絳蟲(chóng)及吸蟲(chóng)類(lèi)，可使蟲(chóng)體發(fā)生強(qiáng)直性收縮而產(chǎn)生痙攣性麻痹［8］。本研究使用阿苯達(dá)唑及吡喹酮作為對(duì)照藥物，阿苯達(dá)唑是代謝系統(tǒng)抑制劑因此藥效時(shí)間較長(zhǎng)，所以在本研究結(jié)果中未出現(xiàn)多房棘球蚴大量死亡(圖1)。有報(bào)道稱，吡喹酮在1 mg/mL以上就可使蟲(chóng)體肌肉瞬間收縮［9］，在蟲(chóng)體形態(tài)表現(xiàn)為頭部變大、尾部變小，這與我們所觀察到的結(jié)果相一致(圖2)。多房棘球絳蟲(chóng)在腸道寄生時(shí)主要使用吸盤(pán)和鉤定植在小腸絨毛間，所以吡喹酮作用可使其無(wú)法固定在小腸絨毛間，從而達(dá)到驅(qū)蟲(chóng)效果。

烈香杜鵑在藏藥中通常以花、葉和嫩枝入藥，有止咳化痰、清熱消腫、補(bǔ)脾益氣等功效［10］。雖然烈香杜鵑常用于氣管炎、肺氣腫和冠心病，但是有報(bào)道稱杜鵑花科植物也具有殺蟲(chóng)作用，如鬧羊花全株可供做農(nóng)藥，藥理作用有去癬殺蟲(chóng)的功效，并且殺蟲(chóng)毒力僅次于除蟲(chóng)菊［11］。有研究表明，烈香杜鵑揮發(fā)油部分具有抑菌作用，對(duì)白色葡萄球菌、四聯(lián)球菌、肺炎球菌、甲型鏈球菌及干燥球菌有抑制作用［12］。本研究發(fā)現(xiàn)使用烈香杜鵑揮發(fā)油在10 mg/mL濃度時(shí)，在0.75 h可基本殺滅多房棘球蚴，5 mg/mL和1 mg/mL在12 h時(shí)多房棘球蚴的死亡率分別是80%和43%，證明烈香杜鵑揮發(fā)油對(duì)多房棘球蚴具有較強(qiáng)的殺滅作用。

有研究對(duì)烈香杜鵑揮發(fā)油化學(xué)成分分析發(fā)現(xiàn)，其中主要成分有芐基丙酮、欖香烯、D－檸檬烯等［13］。其中欖香烯可抑制腫瘤細(xì)胞的DNA和RNA的合成、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡和分化［14］;D－檸檬烯具有消炎、抑菌、抗腫瘤功效［15］。本研究?jī)H說(shuō)明烈香杜鵑揮發(fā)油對(duì)多房棘球蚴具有殺傷作用，但具體是哪種化合物發(fā)揮作用以及明確的作用靶點(diǎn)、作用機(jī)制需進(jìn)一步研究闡明。