何東任，宰紅艷

（中南大學(xué)湘雅醫(yī)院 普通外科，湖南 長(zhǎng)沙410008）

胰腺癌（pancreatic cancer）一種預(yù)后極差的消化道惡性腫瘤，常指胰腺導(dǎo)管腺癌，占胰腺惡性腫瘤的95%以上[1]。近年來(lái)胰腺癌外科技術(shù)日臻完善，圍手術(shù)期病死率和術(shù)后并發(fā)癥發(fā)生率均有顯著下降，但是，其總體手術(shù)切除率和遠(yuǎn)期生存率的提高并不明顯。究其關(guān)鍵原因所在，胰腺癌的解剖部位特殊及其復(fù)雜的腫瘤生物學(xué)行為，導(dǎo)致進(jìn)展迅速，預(yù)后不佳[2]。研究表明，胰腺癌由最初的微觀的非侵入性上皮增生胰腺管，進(jìn)展到晚期，均離不開(kāi)原癌基因的驅(qū)動(dòng)[3]，諸如表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）及乳酸脫氫酶（LDHA）參與調(diào)控胰腺癌細(xì)胞代謝[4]，介導(dǎo)腫瘤局部免疫微環(huán)境異常[5]，促進(jìn)輔助化療與吉西他濱類(lèi)藥物治療抵抗[6-7]。目前對(duì)于EGFR和LDHA在胰腺癌局部免疫微環(huán)境中的作用及相關(guān)的分子機(jī)制仍知之甚少。隨著腫瘤免疫基因組學(xué)（immunogenomics）的進(jìn)展，可以試圖通過(guò)TIMER（Tumor IMmune Estimation Resource）數(shù)據(jù)庫(kù)的研究[8]，找到對(duì)胰腺癌起到關(guān)鍵作用的驅(qū)動(dòng)因子與之相對(duì)應(yīng)的重要信號(hào)通道。因此筆者通過(guò)TIMER數(shù)據(jù)庫(kù)結(jié)合人類(lèi)蛋白表達(dá)圖譜分析了EGFR及LDHA mRNA和蛋白在胰腺癌中的表達(dá)信息，以期為進(jìn)一步研究胰腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制提供有價(jià)值的佐證。

1 資料與方法

1.1 一般資料

TIMER數(shù)據(jù)庫(kù)原發(fā)性胰腺癌組織RNA片段（RNA-seq）測(cè)序表達(dá)數(shù)據(jù)，共計(jì)178例。白種人157例，黑種人6例，其他15例；男98例，女80例；年齡（64.64±10.93）歲；腫瘤直徑0.3～14 cm，平均（3.873±1.078）cm；局部侵潤(rùn)177例，無(wú)侵潤(rùn)1例；腫瘤分化程度G1級(jí)31例、G2級(jí)95例、G3級(jí)48例、G4級(jí)2例、其他2例；區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移N049例、N1120例、N1b 4例、Nd 1例、Nx 4例；無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移（M0）80例、有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移（M1）4例、無(wú)法評(píng)價(jià)有無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移（Mx）94例。TNM分期按AJCC第6版標(biāo)準(zhǔn)：IA 5例、IB 15例、IIA 28例、IIB 119例、III 4例、IV 4例、其他未分期3例。

1.2 TIMER數(shù)據(jù)庫(kù)提取數(shù)據(jù)

運(yùn)行TIMER數(shù)據(jù)庫(kù)（https://cistrome.shinyapps.io/timer）搜索EGFR和LDHA在178例胰腺癌組織中與正常的胰腺組織的差異表達(dá)情況、臨床預(yù)后、體細(xì)胞拷貝數(shù)變異（somatic CNA）、基因表達(dá)相關(guān)性。Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型協(xié)變量：年齡、性別、種族、第6版ACJJ腫瘤TNM分期（II、III、IV期）、腫瘤純度（tumor purity）、免疫細(xì)胞浸潤(rùn)（CD4+T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹(shù)狀突細(xì)胞）和基因表達(dá)?；颊呖傮w生存率預(yù)測(cè)設(shè)置范圍為5%～50%。通過(guò)擬合函數(shù)包R語(yǔ)言包繪制生存曲線。

1.3 人類(lèi)蛋白表達(dá)圖譜組織芯片數(shù)據(jù)庫(kù)提取數(shù)據(jù)

運(yùn)用人類(lèi)蛋白表達(dá)圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.proteinatlas.org）搜索EGFR、LDHA、P38、FOXM1、CSF1和CSF1R蛋白在胰腺癌組織亞細(xì)胞定位（細(xì)胞漿/膜/核）；并與正常的胰腺組織中的表達(dá)豐度相比較。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

EGFR和LDHA mRNA表達(dá)水平用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s），兩者表達(dá)相關(guān)性采用Pearson相關(guān)系數(shù)相分析。TIMER數(shù)據(jù)庫(kù)相關(guān)性分析方法應(yīng)用Spearman等級(jí)相關(guān)性分析。患者生存率采用Kaplan-Meier法計(jì)算，Log-rank法比較總體生存率的差異。Cox回歸模型H R設(shè)定95%可信區(qū)間（CI）。界定P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 EGFR和LDHA在胰腺癌中及其之間的關(guān)系

EGFRm RNA在胰腺癌中的表達(dá)水平為4.96±1.53，在正常胰腺組織中的表達(dá)水平2.15±1.34；LDHA mRNA在胰腺癌中的表達(dá)水平為12.35±2.06，正常胰腺組織中的表達(dá)水平4.53±2.32；兩者在胰腺癌組織中的表達(dá)水平均明顯高于正常胰腺組織（均P＜0.05）（圖1）。Pearson相關(guān)系數(shù)相關(guān)性分析結(jié)果顯示（圖2），EGFR和LDHA mRNA表達(dá)呈明顯正相關(guān)（r=0.511，P＜0.001）。

通過(guò)TIMER數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行Spear man等級(jí)相關(guān)性分析結(jié)果顯示，在胰腺癌局部免疫微環(huán)境中，EGFR和LDHA mRNA表達(dá)呈明顯正相關(guān)（P＜0.001）（圖3）。

圖1 EGFR與LDHA mRNA在胰腺癌和正常胰腺組織中的表達(dá)Figure1 The mRNA expression levels of EGFR and LDHA in pancreatic cancer and normal pancreatic tissues

圖2 胰腺癌組織中EGFR和LDHA mRNA表達(dá)的相關(guān)性分析Figure2 Correlation analysis of between EGFR and LDHA mRNA expressions in pancreatic cancer

圖3 TIMER數(shù)據(jù)庫(kù)EGFR和LDHA mRNA表達(dá)的相關(guān)性分析Figure3 Correlation analysis of between EGFR and LDHA mRNA expressions based on TIMER database

2.2 EGFR和LDHA mRNA高表達(dá)與胰腺癌預(yù)后的關(guān)系

TIMER數(shù)據(jù)庫(kù)收集178例胰腺癌患者基因表達(dá)及總生存期數(shù)據(jù)，根據(jù)設(shè)定中位表達(dá)量35%，分為高表達(dá)及低表達(dá)兩組，預(yù)測(cè)兩組患者間的生存期差異，R語(yǔ)言繪制Kaplan-Meier生存曲線。結(jié)果提示巨噬細(xì)胞、樹(shù)狀突細(xì)胞高表達(dá)及低表達(dá)胰腺癌患者的1、3、5年生存率間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＞0.05），而CD4+T細(xì)胞、EGFR和LDHA mRNA高表達(dá)及低表達(dá)胰腺癌患者的1、3、5年生存率間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.042、0.013、0.001）。CD4+T細(xì)胞高表達(dá)預(yù)后好于其低表達(dá)；EGFR和LDHA低表達(dá)患者預(yù)后好于其高表達(dá)（圖4）。

圖4 TIMER數(shù)據(jù)庫(kù)胰腺癌患者總體生存期分析Figure4 Analysis of the overall survival of pancreatic cancer patients from TIMER database

2.3 胰腺癌預(yù)后影響因素的Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型結(jié)果

Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析結(jié)果顯示：年齡（P=0.005）、腫瘤純度（P=0.042）和LDHA（P＜0.001）是影響胰腺癌預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。而TNM分期、CD4+T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹(shù)狀突細(xì)胞浸潤(rùn)、EGFR表達(dá)水平非胰腺癌預(yù)后獨(dú)立危險(xiǎn)因素（均P＞0.05）（表1）。

表1 胰腺癌患者總體生存率影響因素的Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析Table1 Analysis of influential factors for overall survival of pancreatic cancer patients by using Cox proportional hazard model

2.4 胰腺癌信號(hào)通路分子相關(guān)性表達(dá)分析

基于文獻(xiàn)P38[9]、 FOXM1[10]、 PD-L1[11]、CSF1和CSF1R[12]報(bào)道在胰腺癌發(fā)生發(fā)展中的重要作用。通過(guò)TIMER數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行Spearman等級(jí)相關(guān)性分析（圖5），結(jié)果顯示：EGFR與P38、FOXM1、PD-L1、CSF1和CSF1R表達(dá)呈明顯正相關(guān)（均P＜0.001）；而LDHA與FOXM1、CSF1和CSF1R表達(dá)呈明顯正相關(guān)（均P＜0.001）。

圖5 EGFR、LDHA與胰腺癌相關(guān)分子mRNA表達(dá)的相關(guān)性分析Figure5 Correlation analysis of EGFR and LDHA with the mRNA expressions in the molecules associated with pancreatic cancer

2.5 EGFR、LDHA及胰腺癌信號(hào)通路分子在胰腺癌組織中的表達(dá)

為驗(yàn)證EGFR、LDHA、P38、FOXM1和CSF1R mRNA在胰腺癌組織中的蛋白表達(dá)及定位。通過(guò)人類(lèi)蛋白表達(dá)圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)檢索結(jié)果顯示，EGFR、LDHA、P38、FOXM1和CSF1R蛋白在胰腺癌組織亞細(xì)胞定位細(xì)胞漿或者細(xì)胞膜；并且表達(dá)豐度高于正常胰腺組織（圖6）。

圖6 EGFR、LDHA、P38、FOXM1和CSF1R蛋白在正常胰腺與胰腺癌組織中的表達(dá)Figure6 The protein expression patterns of EGFR, LDHA, P38, FOXM1 and CSF1R in pancreas cancer and normal pancreatic tissues

3 討 論

研究表明，利用生物信息學(xué)技術(shù)，分析和處理胰腺癌相關(guān)高通量數(shù)據(jù)，整合基因組[13]、單核苷酸多態(tài)性（SNP）[14]、miRNA[15]、蛋白質(zhì)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)以及通路功能注釋等信息數(shù)據(jù)，可以迅速準(zhǔn)確地分析某一個(gè)或多個(gè)基因在特定腫瘤中的表達(dá)差異；例如胰腺癌相關(guān)基因（TP53、SMAD4、CDKN2A、ARID1A、ROBO2）、胰腺癌候選驅(qū)動(dòng)基因KDM6A和PREX2；并對(duì)胰腺癌的作用機(jī)制及調(diào)控分子網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行研究[16]，探討胰腺癌腫瘤異質(zhì)性和腫瘤微環(huán)境代謝重編程等分子機(jī)制等[17-18]，可以為合理的科學(xué)假設(shè)的提出奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，這將為胰腺癌的臨床與基礎(chǔ)研究提供新的途徑。

TIMER數(shù)據(jù)庫(kù)能夠從RNA-seq表達(dá)譜數(shù)據(jù)中，檢測(cè)和量化腫瘤組織中免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的情況，由此來(lái)確定腫瘤細(xì)胞-免疫細(xì)胞之間的關(guān)系。利用TIMER數(shù)據(jù)庫(kù)可以精準(zhǔn)量化腫瘤純度、免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的豐度，發(fā)現(xiàn)與患者臨床預(yù)后信息的相關(guān)性。本研究通過(guò)TIMER數(shù)據(jù)庫(kù)分析發(fā)現(xiàn)，在胰腺癌局部免疫微環(huán)境中，EGFR和LDHA mRNA表達(dá)呈顯著性正相關(guān)。研究[19]表明EGFR基因拷貝數(shù)增加或者過(guò)度表達(dá)均能促進(jìn)正常細(xì)胞轉(zhuǎn)化、維持腫瘤干性特征和腫瘤轉(zhuǎn)移。Chen等[20]發(fā)現(xiàn)，在KRAS致癌基因突變發(fā)生，EGFR誘導(dǎo)表達(dá)NFATc1和SOX9基因，導(dǎo)致腺泡細(xì)胞轉(zhuǎn)分化和引發(fā)胰腺癌。Shi等[21]發(fā)現(xiàn)，LDHA和轉(zhuǎn)錄因子Krüppel樣因子4（KLF4）在胰腺腫瘤組織中表達(dá)呈負(fù)相關(guān)；在轉(zhuǎn)錄水平，KLF4作用LDHA啟動(dòng)子區(qū)域，負(fù)調(diào)控LDHA基因轉(zhuǎn)錄活性，抑制LDHA促進(jìn)的胰腺癌糖酵解。He等[22]也發(fā)現(xiàn)LDHA通過(guò)c-Myc信號(hào)通路調(diào)控胰腺癌糖酵解。業(yè)已證實(shí)，腫瘤細(xì)胞代謝和局部免疫微環(huán)境抑制密切相關(guān)[23]。本研究利用相關(guān)性分析方法，發(fā)現(xiàn)EGFR和LDHA的表達(dá)與EGFR、LDHA、P38、FOXM1和CSF1R等表達(dá)相關(guān)，推測(cè)EGFR和LDHA可能是通過(guò)這些信號(hào)分子參與局部免疫微環(huán)境細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移影響生存。

胰腺癌惡性程度極高，具有較強(qiáng)的腫瘤異質(zhì)性，對(duì)其進(jìn)行精準(zhǔn)的分期是指導(dǎo)臨床治療和監(jiān)測(cè)預(yù)后具有重要意義。美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)（AJCC）推出的TNM分期系統(tǒng)已成為當(dāng)前腫瘤分期的“金標(biāo)準(zhǔn)”，并不斷得以更新。日前，AJCC基于最新的循證醫(yī)學(xué)證據(jù)發(fā)布了第8版胰腺癌分期系統(tǒng)，強(qiáng)調(diào)腫瘤大小是影響患者的生存獨(dú)立高危因素[24]。尤為重要的是，第8版胰腺癌分期系統(tǒng)相較第7版分期更細(xì)與預(yù)后的相關(guān)性更大；定義更為清晰，判斷標(biāo)準(zhǔn)更突出客觀性的可測(cè)量指標(biāo)，摒除了主觀性的指標(biāo)。T1～T3根據(jù)腫瘤大小界定，不再使用腫瘤胰腺外侵犯的概念；T4是指腫瘤侵犯腹腔干動(dòng)脈、腸系膜上動(dòng)脈和（或）肝總動(dòng)脈，摒棄可切除性的定義[25]。本研究顯示EGFR和LDHA基因mRNA表達(dá)和預(yù)后生存之間具有顯著的相關(guān)性，高表達(dá)患者預(yù)后差。通過(guò)Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析發(fā)現(xiàn)，LDHA較EGFR能更為準(zhǔn)確的預(yù)測(cè)胰腺癌的臨床預(yù)后。提示LDHA基因在胰腺癌中有可能作為臨床預(yù)后指標(biāo)。但是結(jié)果顯示胰腺癌預(yù)后與TNM分期無(wú)關(guān)，筆者深入分析發(fā)現(xiàn)TIMER數(shù)據(jù)庫(kù)納入的胰腺癌樣本分期標(biāo)準(zhǔn)是基于AJCC第6版標(biāo)準(zhǔn)，此外TIMER數(shù)據(jù)庫(kù)是基于把TNM分期作為協(xié)變量，通過(guò)擬合函數(shù)方法在線分析，可能導(dǎo)致Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析結(jié)果無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。EGFR和LDHA基因表達(dá)聯(lián)合新的TNM分期預(yù)測(cè)預(yù)后還有待在新的隊(duì)列樣本中驗(yàn)證。

盡管目前多數(shù)研究提示，EDFR和LDHA確實(shí)參與了多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，是一種重要的信號(hào)分子，但在胰腺癌局部免疫微環(huán)境中發(fā)揮了何種作用及如何調(diào)控，還需通過(guò)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)更深入探討EGFR和LDHA的作用及機(jī)制，為胰腺癌的免疫治療提供新思路。