陳茹　蘇小青　潘升華　陳了之　周靜　黃益燈

[摘要] 目的 探討緊密連接蛋白claudin-3、claudin-7在鼻咽癌患者組織中的表達(dá)及臨床意義。 方法 收集2014年1月～2016年1月溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院病理科鼻咽癌患者存檔蠟塊標(biāo)本52例作為研究對(duì)象，同時(shí)選擇鼻咽黏膜正常組織20例作為對(duì)照。使用免疫組學(xué)方法檢測(cè)不同鼻咽癌組織中緊密連接蛋白claudin-3、claudin-7表達(dá)情況，分析其與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系，分析鼻咽癌組織中緊密連接蛋白claudin-3、claudin-7表達(dá)程度的相關(guān)性。 結(jié)果 鼻咽癌組織中緊密連接蛋白claudin-3陽性表達(dá)率（51.92%）與正常鼻咽黏膜組織（45.00%）比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。而鼻咽癌組織中緊密連接蛋白claudin-7陽性表達(dá)率（26.92%）與正常鼻咽黏膜組織（55.00%）比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P = 0.025）。claudin-3的陽性表達(dá)率在鼻咽癌Ⅲ+Ⅳ期患者中明顯高于Ⅰ+Ⅱ期患者（P = 0.002）。與緊密連接蛋白claudin-7在不伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的鼻咽癌組織中的表達(dá)（9/15）比較，伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的鼻咽癌組織中的陽性表達(dá)（5/37）明顯降低（P = 0.001）。相關(guān)性分析結(jié)果顯示，緊密連接蛋白claudin-3和claudin-7無明顯相關(guān)性（r = 0.2696，P = 0.0532）。 結(jié)論 claudin-3與腫瘤TNM分期有關(guān)，考慮其在鼻咽癌的發(fā)展中可能起一定的作用。claudin-7表達(dá)下調(diào)可能在鼻咽癌的發(fā)生、轉(zhuǎn)移中發(fā)揮一定的作用，緊密連接蛋白claudin-3和claudin-7有望成為治療鼻咽癌的新靶點(diǎn)。

[關(guān)鍵詞] claudin-3；claudin-7；鼻咽癌；VCA-IgA；免疫組化

[中圖分類號(hào)] R739 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2018）11（b）-0101-05

[Abstract] Objective To explore the expression of claudin-3， claudin-7 in patients with nasopharyngeal carcinoma（NPC） and to analyze the relationship between the proteins and clinical significance. Methods Fifty-two archival paraffin embedded tissue specimens of nasopharyngeal were retrospectively analyzed from January 2014 to January 2016 at the Third Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University. Another 20 samples of Histologically normal nasopharyngeal tissues were also obtained as control group. Immunohistochemstry was used to detect the expression of claudin-3 and claudin-7 in the different tissues， and the relationship was analyzed between the expression and clinic pathological parameter. The relationship of the expression levels of claudin-3 and claudin-7 in nasopharyngeal carcinoma tissues was analyzed. Results There was no statistically significant difference in the positive expression rate of claudin-3 （51.92%） between nasopharyngeal carcinoma and adjacent non-neoplastic tissues （45.00%） （P > 0.05）. While the positive expression rate of claudin-7 in nasopharyngeal carcinomas （26.92%）， in comparison with the adjacent non-neoplastic tissues （55.00%）， there was significant difference （P = 0.025）. The positive expression rate of claudin-3 in the Ⅲ+Ⅳ stage patients was significantly higher than that in the Ⅰ+Ⅱ stage patients （P = 0.002）. Compared with the positive expression rate of claudin-7 in nasopharyngeal carcinomas without cervical lymph node metastasis （9/15）， the positive expression rate in nasopharyngeal carcinomas with cervical lymph node metastasis was remarkably lower （5/37） （P = 0.001）. Correlation analysis results showed that there was no relationship between expression of claudin-3 and claudin-7 （r = 0.2696， P = 0.0532）. Conclusion claudin-3 relates to the TNM tumor staging， in consideration of the effect in the nasopharyngeal carcinoma progress. claudin-7 decreased expression plays a role in the occurrence and development of nasopharyngeal carcinoma. claudin-3 and claudin-7 may be novel biomarkers for the new target for nasopharyngeal carcinoma treatment.

[Key words] claudin-3； claudin-7； Nasopharyngeal carcinoma； VCA-IgA； Immunohistochemistry

鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多基因參與、多階段變異累積形成的病理過程。尋找鼻咽癌的分子標(biāo)志物將有利于鼻咽癌患者個(gè)體化治療方案的選擇及預(yù)后的評(píng)估。緊密連接蛋白是緊密連接的骨架蛋白[1]，參與緊密連接的形成及細(xì)胞間的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。目前已有較多研究報(bào)告緊密連接蛋白claudin-3、claudin-7在肺腺癌等惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中扮演著重要角色，參與構(gòu)成惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)路[2]，而claudin-3、claudin-7在鼻咽癌中的研究甚少，深入研究claudin-3、claudin-7與鼻咽癌的相關(guān)性，可能成為生物分子治療新的方向。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2014年1月～2016年1月溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院病理科臨床資料完整、病理診斷明確的鼻咽癌存檔蠟塊標(biāo)本52例作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，其中男40例，女12例；年齡11～85歲（中位年齡44.6歲）。收集全部病例的血清VCA-IgA陽性情況，根據(jù)抗體滴度分為+（低滴度，1∶5～1∶20），++（中滴度，1∶40～1∶80），+++（高滴度，>1∶160），其中陰性6例，低滴度13例，中滴度23例，高滴度10例。按WHO國(guó)際組織分類標(biāo)準(zhǔn)，組織病理類型包括未角化性癌46例，角化鱗狀細(xì)胞癌6例；按2010年國(guó)際抗癌聯(lián)盟UICC/AJCC TNM臨床分期：Ⅰ+Ⅱ期病例32例，Ⅲ+Ⅳ病例20例；頸部淋巴轉(zhuǎn)移病例37例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移病例15例。同時(shí)另選取癌旁鼻咽黏膜正常組織20例作為對(duì)照。所有病例均為初發(fā)病例，均未接受手術(shù)、放化療等治療。

1.2 主要試劑和檢測(cè)方法

抗人claudin-7抗體及其免疫組化試劑盒（美國(guó)abcam公司），抗人claudin-3抗體及其免疫組化試劑盒（上海長(zhǎng)島生物技術(shù)有限公司）。采用SP法免疫組化染色，操作步驟按說明書進(jìn)行，用PBS液代替一抗作為每次染色的陰性對(duì)照。在顯微鏡下觀察，以細(xì)胞膜和＼或細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)黃棕色著色顆?；驁F(tuán)塊為細(xì)胞中claudin-3、claudin-7陽性。根據(jù)細(xì)胞染色強(qiáng)度計(jì)分：無染色為0分；有染色中淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。每張切片隨機(jī)觀察10個(gè)高倍視野，計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞，根據(jù)陽性細(xì)胞所占比例不同分為4級(jí)：陽性細(xì)胞比例≤10%為0分，>10%～50%為1分，>50%～75%為2分，>75%～100%為3分?？偟拿庖呷旧u(píng)分=免疫染色強(qiáng)度計(jì)分×陽性細(xì)胞比例分級(jí)計(jì)分。根據(jù)各指標(biāo)的免疫染色評(píng)分將結(jié)果分為：陰性（-）為0分，弱陽性（+）為1～2分，陽性（++）為3～4分，強(qiáng)陽性（+++）為5～9分。陽性表達(dá)率=（弱陽性例數(shù)+陽性例數(shù)+強(qiáng)陽性例數(shù)）/總例數(shù)×100%。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，比較claudin-3和claudin-7在鼻咽癌組織及癌旁正常組織中的陽性表達(dá)率，采用Fisher確切概率法（當(dāng)T<1或n<40）或使用χ2檢驗(yàn)校正公式（當(dāng)140）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用χ2檢驗(yàn)分析claudin-3和claudin-7與各臨床病理學(xué)因素之間的關(guān)系。用重復(fù)方差分析進(jìn)行claudin-3和claudin-7在血清VCA-IgA各滴度間兩兩比較。用Spearman相關(guān)分析分析claudin-3與claudin-7表達(dá)程度相關(guān)性。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 緊密連接蛋白claudin-3、claudin-7在不同組織中的表達(dá)

claudin-3、claudin-7在鼻咽癌及癌旁正常組織中的細(xì)胞膜和＼或胞漿呈黃褐色顆粒（圖1～2，封三）。claudin-3在癌旁正常組織中陽性表達(dá)率為45.00%，而在鼻咽癌中的表達(dá)率為51.92%。二者比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P = 0.599）。claudin-7在癌旁正常組織中陽性表達(dá)率為55.00%，而在鼻咽癌中的表達(dá)率為26.92%，其在鼻咽癌中的表達(dá)明顯較癌旁正常組織低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P = 0.025）。見表1。

2.2 鼻咽癌組織中緊密連接蛋白claudin-3和claudin-7表達(dá)與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系

不同性別、年齡、頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、血清VCA-IgA陽性率、病理分型患者的claudin-3表達(dá)水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）；但不同TNM分期中，Ⅰ+Ⅱ期患者claudin-3陽性表達(dá)率為34.38%，低于在Ⅲ+Ⅳ期患者（80.00%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P = 0.002）。不同性別、年齡、血清VCA-IgA陽性率、病理分型及TMN分期患者claudin-7陽性表達(dá)水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05），claudin-7在伴有頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移鼻咽癌組織中的陽性表達(dá)率為13.51%，低于不伴有頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移鼻咽癌組織（60.00%），差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P = 0.001）。見表2。

2.3 鼻咽癌組織中claudin-3和claudin-7在不同滴度血清VCA-IgA患者中的表達(dá)

血清VCA-IgA陰性的claudin-3陽性表達(dá)率為16.67%（1/6），低于血清VCA-IgA高滴度患者[70.00%（7/10）]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P = 0.028）。claudin-7陽性表達(dá)率在血清VCA-IgA陰性、低滴度、中滴度、高滴度中的陽性表達(dá)率（0.00%、38.46%、34.78%、10.00%）兩兩比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。

2.4 鼻咽癌組織中claudin-3和claudin-7表達(dá)的相關(guān)性分析

Spearman相關(guān)分析結(jié)果提示，鼻咽癌組織中claudin-3和claudin-7表達(dá)無明顯相關(guān)性（r = 0.2696，P > 0.05）。見表3。

3 討論

鼻咽癌是我國(guó)頭頸部最高發(fā)的惡性腫瘤，有研究[3-4]顯示，早期鼻咽癌患者經(jīng)過正規(guī)放化療治療后，治愈率可達(dá)到90%，而其中有30%～40%的患者仍會(huì)出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和局部復(fù)發(fā)，從而導(dǎo)致鼻咽癌的治療失敗。而Li等[5]研究發(fā)現(xiàn)在初診時(shí)就已伴有轉(zhuǎn)移的鼻咽癌患者占60%，其中以頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移為主，比例達(dá)到79.8%。腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移是從離開原發(fā)組織的癌細(xì)胞擴(kuò)散侵犯至鄰近周圍組織結(jié)構(gòu)開始；并通過其入侵的血管或淋巴管，繼續(xù)到達(dá)遠(yuǎn)處組織；在停留的部位重新形成新的轉(zhuǎn)移瘤[6]。因此，探索鼻咽癌的轉(zhuǎn)移機(jī)制和尋找能提示鼻咽癌轉(zhuǎn)移的分子標(biāo)志物一直是各個(gè)實(shí)驗(yàn)室研究的熱點(diǎn)。

近年研究表明claudins不僅維持上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的柵欄功能、屏障功能[7]，并有研究顯示在惡性腫瘤發(fā)展的一系列病理生理過程中發(fā)揮一定作用[8]。claudins在不同的腫瘤組織中呈現(xiàn)不同的表達(dá)，發(fā)揮不一樣的作用，claudin-3也是如此。Soini[9]通過免疫組化檢測(cè)發(fā)現(xiàn)claudin-3在腎癌、膀胱癌組織中表達(dá)下調(diào)，而淋巴瘤中不表達(dá)?？紤]與發(fā)生腫瘤時(shí)，緊密連接結(jié)構(gòu)破壞，細(xì)胞間黏附性降低或丟失，失去限制腫瘤細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)和相關(guān)生長(zhǎng)因子供應(yīng)的作用，而使腫瘤細(xì)胞缺乏分化，侵襲力增強(qiáng)等情況相符。Kominsky等[10]研究顯示claudin-3在肺癌、前列腺癌、乳腺癌、胃癌、卵巢癌組織中的表達(dá)較正常組織升高；又有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，claudin-3在結(jié)直腸癌中表達(dá)亦上調(diào)，并表示表達(dá)越強(qiáng)，預(yù)后可能越差，提出claudin-3可能成為判斷結(jié)直腸癌預(yù)后的標(biāo)志物[11]。在腫瘤發(fā)生、發(fā)展及浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移過程中均可出現(xiàn)claudins蛋白的表達(dá)降低或缺失，可能跟腫瘤細(xì)胞間黏附功能的破壞、異型性增大及侵襲力增加等方面有關(guān)[12]。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，WNK4激酶能夠使claudin-3蛋白磷酸化，指出細(xì)胞間緊密連接蛋白的正常功能可能因claudin-3蛋白的磷酸化而遭到破壞[13]。有研究發(fā)現(xiàn)小鼠卵巢癌細(xì)胞的生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移可被claudin-3小干擾RNA（siRNA）所抑制[13]，并認(rèn)為這種介導(dǎo)claudin-3基因沉默的siRNA可能是潛在的抗腫瘤藥物。

綜上所述，深入研究claudin-3蛋白與腫瘤的關(guān)系有可能成為腫瘤靶向治療的新方向[14]。本研究顯示claudin-3在鼻咽癌組織中的陽性表達(dá)率高于癌旁組織，但兩者的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P = 0.599）。其中claudin-3陽性表達(dá)與患者性別、年齡、有無頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、血清VCA-IgA陽性率、病理分型等無明顯相關(guān)性（P > 0.05），但同TNM分期相關(guān)，Ⅰ+Ⅱ期患者中claudin-3陽性率為34.38%，低于在Ⅲ+Ⅳ患者中claudin-3陽性率的80.00%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P = 0.002）。在病理分期更高的鼻咽癌組織中claudin-3表達(dá)陽性率更高。血清VCA-IgA陰性的鼻咽癌組織中的claudin-3表達(dá)陽性率16.67%（1/6）低于血清VCA-IgA高滴度的病例中的claudin-3表達(dá)陽性率70.0%（7/10）（P < 0.05）。有多項(xiàng)研究[15-17]顯示血清VCA-IgA滴度與鼻咽癌的臨床分期有關(guān)，總結(jié)得出claudin-3表達(dá)升高與鼻咽癌臨床分期有關(guān)，可能在鼻咽癌的病程發(fā)展中起一定的作用。

Al等[18]通過RT-PCR及Western blot研究發(fā)現(xiàn)，claudin-7在頭頸部鱗癌中的表達(dá)與在周圍正常組織中的表達(dá)相比明顯降低。Suren等[19]對(duì)18例鼻咽癌組織及癌旁組織，用免疫組化方法檢測(cè)研究claudins的表達(dá)與預(yù)后相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)claudin-7表達(dá)與預(yù)后相關(guān)；Kondoh等[20]對(duì)28例扁桃體鱗狀細(xì)胞癌組織及正常組織進(jìn)行對(duì)照研究，用免疫組化方法分析claudin表達(dá)，結(jié)果顯示在原發(fā)鱗狀細(xì)胞癌和轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中claudin-7均少表達(dá)或缺如，claudin-7表達(dá)下調(diào)表現(xiàn)在腫瘤進(jìn)展的全過程。又有學(xué)者檢測(cè)了32例喉癌患者的癌組織和癌旁組織中的claudin-7 mRNA的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)其在癌組織中較形態(tài)正常的癌旁組織出現(xiàn)明顯下降[21-22]，提示claudin-7的表達(dá)與惡性腫瘤的組織病理學(xué)特點(diǎn)呈負(fù)相關(guān)，與腫瘤發(fā)展密切相關(guān)。故claudin-7普遍被認(rèn)為是一種潛在的腫瘤抑制劑。claudin-7在癌旁正常組織中的陽性表達(dá)率為55.00%（11/20），而在鼻咽癌中的表達(dá)率為26.92%（14/52），兩者陽性表達(dá)率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P = 0.025）；緊密連接蛋白claudin-7在不伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的鼻咽癌組織中的表達(dá)（9/15），較伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的鼻咽癌組織（5/37）明顯降低，兩者差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P = 0.001）。與以上對(duì)claudin-7在頭頸部腫瘤中的研究類似，對(duì)于可能的原因國(guó)外有研究顯示，轉(zhuǎn)錄因子Snail可與編碼claudin-7基因的啟動(dòng)子的E.Box直接結(jié)合，抑制啟動(dòng)子活性，使claudin-7蛋白表達(dá)下調(diào)[23]。而claudin-7基因的啟動(dòng)子甲基化可使claudin-7蛋白表達(dá)降低[24]。claudin-7蛋白表達(dá)的降低或缺失，使緊密連接結(jié)構(gòu)破壞、功能障礙，引起腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)所需的生長(zhǎng)因子和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)擴(kuò)散，致腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)失控，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移[25]，進(jìn)一步支持claudin-7可能是腫瘤抑制劑。本研究顯示claudin-7表達(dá)水平與臨床病理參數(shù)、性別、年齡、血清VCA-IgA陽性率、病理分型及TMN分期無明顯相關(guān)性（P > 0.05）。claudin-7在鼻咽癌中出現(xiàn)了表達(dá)的異常，緊密連接結(jié)構(gòu)遭到破壞，細(xì)胞極性喪失，生長(zhǎng)失控，與國(guó)外研究類似[26]。claudin-7表達(dá)下降甚缺失參與了腫瘤的發(fā)生過程，促進(jìn)了腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。

近年來，細(xì)胞連接功能異常在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的作用逐漸受到重視，干預(yù)其中關(guān)鍵蛋白抑制腫瘤生長(zhǎng)已經(jīng)成為腫瘤研究的新熱點(diǎn)。claudin-3和claudin-7表達(dá)異常與鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，對(duì)其進(jìn)行深入研究，有望成為治療鼻咽癌的新靶點(diǎn)。

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（收稿日期：2018-05-04 本文編輯：金 虹）