張 鑫， 閆衛(wèi)疆 ， 高宏偉 ， 王芳梅 ， 谷盼盼， 許若男，張修珂， 希力阿扎提·阿不力米提， 王英美， 王 亮*

（1.新疆大學生命科學與技術(shù)學院，新疆烏魯木齊 830046；2.新疆泰昆集團股份有限公司，新疆昌吉 831100）

豆粕是飼料中的主要蛋白源，因其具有良好的營養(yǎng)特性，所以其對畜禽飼料的成本具有很大的影響。近年來，由于養(yǎng)殖業(yè)的迅猛發(fā)展和糧食價格上漲，豆粕供不應求，導致飼料企業(yè)的利潤減少，尋找優(yōu)質(zhì)的蛋白源已成為動物飼料營養(yǎng)研究的重點（張艷銘2006）。高蛋白棉籽粕是替代豆粕理想的植物性蛋白原料，其是以棉籽為原料榨油后的副產(chǎn)品,含粗蛋白質(zhì)50%左右,含有較豐富的蛋氨酸、胱氨酸,但其賴氨酸含量較低（劉紹娟等，2016；周培校等，2009）。新疆是我國的主要產(chǎn)棉地區(qū)，其棉花資源豐富，因此產(chǎn)生了大量的榨油產(chǎn)物棉籽粕。新疆是棉籽粕的原產(chǎn)地，選擇其代替部分豆粕，可以降低飼料成本，充分利用資源 （Dmsd 等，2011；Gui等，2010； 郭書賢等，2009）。蛋白質(zhì)和鈣是產(chǎn)蛋雞飼料配方的兩項重要因素，飼料中蛋白質(zhì)含量決定了飼料的品質(zhì)和成本（任善茂等，2017）。鈣是動物所必需的礦物元素之一，而且其是動物所需礦物元素中量最大的元素（陳娟2011）。

本文采用胃蛋白酶-胰酶兩步法測定飼料中蛋白質(zhì)、鈣的消化率，確定產(chǎn)蛋雞飼料配方中高蛋白棉籽粕替代豆粕的最適添加量以及石粉的需要量，提高飼料消化率，優(yōu)化飼料配方，降低蛋雞養(yǎng)殖成本，充分利用棉籽粕資源。

1 材料與方法

1.1 試驗飼料 試驗采用玉米-豆粕型基礎(chǔ)飼料NRC（1994）。飼料蛋白來源包括豆粕（市購）、高蛋白棉籽粕（新疆泰昆集團股份有限公司）。其中高蛋白棉籽粕的營養(yǎng)成分∶干物質(zhì)92.3%、粗蛋白質(zhì)56%、灰分 12.1%、含鈣量 0.25%、游離棉酚160 mg/kg。豆粕的營養(yǎng)成分：干物質(zhì)89.2%、粗蛋白質(zhì)45.7%、灰分6.91%、含鈣量0.31%。

試驗飼料基礎(chǔ)配方：玉米59.3%、豆粕26.7%、石粉8%、磷酸氫鈣1.7%、預混料1%、植物油1%、食鹽0.3%、沸石粉2%。

1.2 主要試驗儀器 分析天平FA1004，精密pH計（精確到0.01），RHP-1000A型高速多功能粉碎機，SHB-III循環(huán)水式多用真空泵，THZ-82恒溫振蕩器，101型電熱鼓風干燥箱，透析袋（截留分子質(zhì)量8000～14000 Da，直徑是44 mm）。

1.3 主要化學試劑 胃蛋白酶（活性1∶3000），購于上海藍季科技發(fā)展有限公司。胰酶 （活性1∶4000），購于上海源葉生物科技有限公司。鹽酸（AR），氫氧化鈉（AR），乙酸（AR），乙酸鈉（AR），磺基水楊酸（AR）。

1.4 基本成分測定 粗蛋白質(zhì)的測定：GB/T 6432—94；粗灰分的測定：GB/T 6438—2007；水分的測定：GB/T 6435—2014；游離棉酚的測定：GB 13086—91；鈣含量的測定：GB/T 6436—2002。

1.5 試驗方法 本研究采用胃蛋白酶-胰酶兩步法測定飼料中蛋白質(zhì)、鈣的體外消化率（黃輝，2009；孫育平等，2005；張鐵鷹 2002；黃瑞林等，1999）。

胃消化階段：準確稱取1.0000 g過60目篩的飼料樣品，放入錐形瓶中并加入10 mL乙酸乙酸鈉緩沖溶液 （pH=3），小心混合后加入0.5 mL的0.01 mol/L的鹽酸胃蛋白酶溶液并封口。充分混勻后放入溫度為40℃的振蕩器內(nèi)消化，振蕩頻率為120次/min，時間為75 min。

小腸消化階段：胃消化期結(jié)束后，逐滴加入1 mol/L氫氧化鈉溶液，調(diào)整食糜液的pH至6.5。先將透析袋一端用夾子夾緊，倒入16 mL相應pH的乙酸乙酸鈉緩沖溶液，再將中和后的樣品和胰酶轉(zhuǎn)移到透析袋中，夾緊透析袋的另一端。置于500 mL的錐形瓶中并加入400 mL的緩沖液，將錐形瓶封口后放入恒溫振蕩器，振蕩頻率120次/min，時間為180 min。消化結(jié)束后，將20%的磺基水楊酸溶液5 mL加入到透析袋中。室溫靜置30 min后過濾，用1%磺基水楊酸溶液沖洗透析袋中的殘留物。將殘渣及濾紙于105℃的烘箱中烘至恒重，測定干物質(zhì)和蛋白質(zhì)。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 原始數(shù)據(jù)采用Excel初步整理，然后采用SPSS 16.0軟件進行單因素方差分析，采用Duncan法多重比較，P＜0.05為差異顯著，采用GraphPad Prism 5作圖。采用Design Expert 8.0軟件中的Box-Benhnken進行響應面優(yōu)化設(shè)計，并對數(shù)據(jù)進行模型擬合以及方差分析。數(shù)值以“平均數(shù)±標準差”表示。

2 結(jié)果與討論

2.1 體外消化試驗最適酶用量的選擇

2.1.1 胃蛋白酶最適用量的選擇 選擇胃蛋白酶濃度為 40、50、60、70、80 mg/mL，以高蛋白棉籽粕為底物進行消化試驗，所得結(jié)果如圖1所示，由此確定最適的胃蛋白酶濃度為70 mg/mL。

圖1 胃蛋白酶濃度對消化率的影響

2.1.2 胰酶最適用量的選擇 濃度為70 mg/mL的胃蛋白酶消化高蛋白棉籽粕75 min后，再分別加入含胰酶 30、40、50、60、70 mg 的乙酸乙酸鈉緩沖溶液，繼續(xù)消化 180 min，結(jié)果如圖2所示。確定胰酶的最適用量為50 mg。

圖2 胰酶濃度對消化率的影響

2.2 棉籽粕最適替代量的確定 以試驗飼料基礎(chǔ)配方為基礎(chǔ)，根據(jù)等氮等能的原則，分別加入0、50、100、150、200 g/kg 的高蛋白棉籽粕替代豆粕，配制一種蛋白源為豆粕、高蛋白棉籽粕的產(chǎn)蛋雞飼料。不同高蛋白棉籽粕替代部分豆粕的配合飼料的體外消化如圖3所示。高蛋白棉籽粕添加量為100 g/kg時，干物質(zhì)消化率達到最高點，蛋白質(zhì)消化率也較高，分別為56.9%、57%，之后隨著棉籽粕添加量的增加，體外消化率顯著下降。

圖3 棉籽粕添加量對消化率的影響

高蛋白棉籽粕添加量為100 g/kg時呈現(xiàn)出較高的干物質(zhì)和蛋白質(zhì)消化率，根據(jù) 《飼料衛(wèi)生標準》產(chǎn)蛋雞飼料中的游離棉酚≤20 mg/kg，故高蛋白棉籽粕的最適添加量為100 g/kg。

2.3 角蛋白酶添加量的確定 在含100 g/kg高蛋白棉籽粕的飼料基礎(chǔ)上，添加0.0%、0.03%、0.06%、0.09%、0.12%角蛋白酶，研究不同角蛋白酶添加量對配合飼料消化率的影響，從而確定角蛋白酶的最適添加量，優(yōu)化產(chǎn)蛋雞飼料配方。結(jié)果如圖4所示，隨著角蛋白酶添加量的增加，飼料干物質(zhì)消化率先增加后降低，當角蛋白酶添加量為0.09%時，體外消化率顯著較高。蛋白質(zhì)消化率與干物質(zhì)消化率都呈現(xiàn)出先增后減的趨勢，添加0.09%的角蛋白酶蛋白質(zhì)消化率和干物質(zhì)消化率達到最大值，分別為61%、59.3%。綜合考慮角蛋白酶不同添加量對體外消化率的影響，確定角蛋白酶的需要量范圍為0.09%。

圖4 角蛋白酶添加量對消化率的影響

2.4 石粉最適需要量的確定 石粉的主要成分是碳酸鈣，一般作為飼料中鈣的補充劑。在上述添加角蛋白酶飼料配方的基礎(chǔ)上，分別添加4%、5.3%、6.6%、8%、9.2%石粉，增加沸石粉以達到配比平衡。結(jié)果如圖5所示。隨著石粉添加量的增加，飼料干物質(zhì)消化率和鈣消化率呈現(xiàn)出先增后減的趨勢，當石粉添加量為8%時，試樣的干物質(zhì)和鈣體外消化率最高，顯著高于其他試驗組。

圖5 含鈣量對消化率的影響

結(jié)合考慮石粉不同添加量對飼料體外消化率的影響，選擇石粉的最適需要量為8%。

2.5 磷最需用量的確定 在含100 g/kg高蛋白棉籽粕的飼料基礎(chǔ)上，添加1.2%、1.3%、1.5%、1.6%、1.7%磷酸氫鈣，增加沸石粉以達到配比平衡。結(jié)果如圖6所示，隨著磷添加量的增加,飼料干物質(zhì)消化率和鈣消化率呈現(xiàn)出先增后減的趨勢，當磷酸氫鈣添加量為1.6%時，試樣的體外消化率顯著高于其他試驗組（P＜0.05）。

綜合考慮磷不同添加量對飼料體外消化率的影響，確定磷酸氫鈣的最適添加量為1.6%。

圖6 含磷量對消化率的影響

2.6 卵磷脂需要量的確定 在含100 g/kg高蛋白棉籽粕的飼料基礎(chǔ)上，添加0%、1%、2%、3%、4%卵磷脂，研究卵磷脂不同添加量對產(chǎn)蛋雞配合飼料的影響，從而選取最適卵磷脂需要量，優(yōu)化產(chǎn)蛋雞飼料配方。如圖7所示，隨著卵磷脂添加量的增加，蛋白質(zhì)、鈣消化率變化顯著，呈現(xiàn)先增后減的趨勢，在卵磷脂添加量為2%時，蛋白質(zhì)、鈣消化率顯著高于其他試驗組。

綜合考慮卵磷脂不同添加量對飼料體外消化率的影響，確定卵磷脂的添加量為2%。

圖7 卵磷脂添加量對消化率的影響

2.7 響應面優(yōu)化產(chǎn)蛋雞飼料配方 以角蛋白酶、石粉、磷酸氫鈣、卵磷脂的添加量為考察因素，以蛋白質(zhì)和鈣的消化率為綜合評價指標，綜合評分=樣品中蛋白質(zhì)消化率/該組樣品中蛋白質(zhì)最高消化率×60+樣品中鈣消化率/該組樣品中最高鈣消化率×40，進行響應面優(yōu)化試驗，因素水平見表1，試驗結(jié)果和回歸模型見表2、表3。

表1 因素水平編碼表

表2 響應面試驗方案及結(jié)果

對表2中數(shù)據(jù)進行回歸擬合，得到自變量與綜合評分（Y）的二次多項回歸方程為：

Y=93.78+1.4A+1.53B+10.51C+2.79D+0.55AB-0.73AC-0.23AD-1.87BC-0.67BD+0.32CD-1.23A2-1.65B2-7.16C2-4.84D2。

由表3對模型進行的方差分析結(jié)果可知，模型P＜0.0001，表明回歸模型達到極顯著，因變量與所有自變量之間的線性關(guān)系顯著 （R2=0.9928）。失擬項P=0.0519＞0.05，模擬失擬項不顯著；該回歸模型的調(diào)整決定系數(shù)R2Adj=0.9856，變異系數(shù)CV=1.16，說明該模型擬合程度良好，試驗誤差小，故該回歸方程模型成立，可用此模型對綜合評分結(jié)果進行分析及預測?；貧w方程各項方差分析表明， 因素 A、B、C、D、BC、A2、B2、C2、D2對綜合評分有極顯著的影響（P ＜ 0.01），因子 AB、AC、AD、BD、CD對綜合評分影響不顯著（P＞0.05）。

表3 回歸方程的方差分析

響應面優(yōu)化設(shè)計最終確定了最佳配方，結(jié)果見表4，綜合評分為97.5，在此條件下進行試驗，得配方的蛋白質(zhì)消化率為62.8%，鈣消化率為39.8%，與預測值接近。

3 結(jié)論

本文以蛋白質(zhì)和鈣為指標通過體外消化的方法對產(chǎn)蛋雞飼料配方進行了優(yōu)化。試驗表明在原有基礎(chǔ)飼料上，棉籽粕可添加10%，替代部分豆粕，石粉和磷酸氫鈣的需要量為8.1%和1.77%，角蛋白酶的添加量為0.088%，卵磷脂的添加量為2.1%，飼料呈現(xiàn)出較高的蛋白質(zhì)消化率（62.8%）和鈣消化率（39.8%）。本文研究所得優(yōu)質(zhì)產(chǎn)蛋雞飼料能夠降低飼料成本，提高飼料企業(yè)利潤，充分利用本地榨油副產(chǎn)物，但其在養(yǎng)殖中的實際應用還有待進一步研究和驗證。

表4 最佳飼料配方%