張海波，鄭先杰

有報道稱經(jīng)皮冠脈介入術(shù)（PCI）治療冠狀動脈粥樣硬化性心臟?。ü谛牟。╇m可獲取一定療效，但支架內(nèi)血栓、消化道出血、冠狀動脈痙

攣等并發(fā)癥發(fā)生率高，其中支架內(nèi)血栓發(fā)生率高達(dá)1.5%，故往往輔以阿司匹林聯(lián)合氯吡格雷治療，能有效降低患者心血管事件發(fā)生率[1]。但由于血栓形成機(jī)制十分復(fù)雜，有研究發(fā)現(xiàn)于PCI術(shù)前行抗血小板治療，患者術(shù)后仍有可能出現(xiàn)血栓性事件，故關(guān)于抗血小板藥物的抵抗或反應(yīng)變異性已成為了研究重點(diǎn)[2]。目前，有報道顯示有關(guān)功能蛋白編碼基因多態(tài)性會影響氯吡格雷的反應(yīng)變異性，不同基因型誘導(dǎo)氯吡格雷反應(yīng)性不同，最終導(dǎo)致不同臨床事件[3]。目前有關(guān)氯吡格雷的反應(yīng)變異性基因多態(tài)性研究報道較少，多集中于一些環(huán)節(jié)（如吸收、代謝轉(zhuǎn)化、與受體結(jié)合等）中相關(guān)功能蛋白編碼基因[4]?；诖耍狙芯恐荚谔骄縋CI術(shù)后患者氯吡格雷反應(yīng)性與CYP2C19基因多態(tài)性的相關(guān)性，報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料納入2015年8月～2017年8月于河南大學(xué)第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科收治的擇期行PCI術(shù)的164例冠心病患者為對象，開展回顧性分析，本研究已獲得院倫理委員會批準(zhǔn)。其中，男性92例，女性72例，年齡25～74（65.93±9.47）歲；合并高血壓90例，合并2型糖尿病57例。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn)①符合《冠心病防治指南》[5]中相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)，均經(jīng)冠脈造影確診為冠心病；②行PCI治療成功，預(yù)計術(shù)后存活時間＞1年；③年齡≥25歲；④對本研究知情且簽署同意書。

1.3 排除標(biāo)準(zhǔn)①合并嚴(yán)重心、肝、腎等重要臟器系統(tǒng)疾病及精神疾患；②對阿司匹林、氯吡格雷及造影劑過敏者；③血流動力學(xué)不穩(wěn)定者，其中收縮壓＜90 mmHg及（或）舒張壓＜50 mmHg（1 mmHg=0.133kPa）；④伴既往腦出血、消化性或活動性潰瘍史等出血性疾病史；⑤參加本研究前3個月存在嚴(yán)重外傷史或重大手術(shù)史；⑥出血體質(zhì)或血液病，紅細(xì)胞壓積＜30%，血小板計數(shù)＜100×109/L；⑦依從性差者。

1.4 研究方法

1.4.1 治療方法所有患者按照具體病情于PCI術(shù)前1 d給予阿司匹林100～300 mg/d+負(fù)荷量氯吡格雷300 mg/d，術(shù)后分別行100 mg/d、75 mg/d的維持劑量治療，阿司匹林長期服用，氯吡格雷連續(xù)服用12個月。

1.4.2 檢測方法

1.4.2.1 儀器與試劑采用LBY-NJ4型四通道血小板聚集儀（購自北京鑫骉騰達(dá)儀器設(shè)備有限公司）、Centrifuge 54150 離心機(jī)（Eppendorf公司）、 SY-420電熱式恒溫水浴鍋（天津歐諾儀器儀表有限公司）、AG 22331 Hambarg PCR擴(kuò)增儀（Eppendorf公司），全血基因組DNA提取試劑盒、96孔板及其他材料均購自廈門市云鵬科技發(fā)展有限公司。

1.4.2.2 血小板聚集率檢測方法分別于服藥前及服藥后第7 d清晨采集靜脈血5 ml，加入3.8%枸櫞酸鈉抗凝管中混勻，離心處理后留取上清液分裝，置于-80℃冰箱保存待檢。于2 h內(nèi)應(yīng)用光比濁法行血小板聚集率檢測。采用LBY-NJ4型四通道血小板聚集儀，誘導(dǎo)劑取20 μmol/L二磷酸腺苷（ADP）。血小板聚集率=服藥前最大血小板聚集率-服藥后7 d最大血小板聚集率。當(dāng)血小板聚集率≥10%時，則為氯吡格雷正常反應(yīng)（NCLR）；＜10%時，即為氯吡格雷低反應(yīng)（CLR）。按照血小板抑制率將其分為NCLR組102例與CLR組62例。

1.4.2.3 CYP2C19基因型檢測方法參照CYP2C19基因檢測試劑盒說明書，采用DNA微陣列芯片法行基因測定。經(jīng)金黃色葡萄球A蛋白酶處理后自全血中行DNA提取，并設(shè)計引物序列（見表1），行引物單堿基延伸、PCR擴(kuò)增、雜交顯色、芯片點(diǎn)樣、質(zhì)譜檢測，最終借助軟件分析數(shù)據(jù)，獲取CYP2C19 基因型結(jié)果。

1.5 觀察指標(biāo)統(tǒng)計患者出院時基線資料，包括性別、年齡、吸煙史、飲酒史、糖尿病、高血壓、體質(zhì)指數(shù)、膽固醇、三酰甘油、血小板計數(shù)，并統(tǒng)計鈣通道阻滯劑類、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑類、他汀類、血管緊張素受體拮抗劑類、β-受體阻滯劑使用情況。經(jīng)CYP2C19*2、CYP2C19*3位點(diǎn)酶切產(chǎn)物電泳圖像分析基因分型，主要包括野生型G/G（CYP2C19*2、CYP2C19*3位點(diǎn)均為野生型，*1/*1）、雜合子G/A（1個位點(diǎn)為野生型，另一個位點(diǎn)為雜合突變型，*1/*2，*1/*3）、純合子A/A（CYP2C19*2、CYP2C19*3位點(diǎn)均為雜合突變型，或1個位點(diǎn)為純合突變型，*2/*2，*2/*3）與等位基因G、A。觀察兩組CYP2C19*2、CYP2C19*3的基因型和等位基因頻率分布特點(diǎn)。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 19.0處理數(shù)據(jù)，計數(shù)資料計算構(gòu)成比，組間比較行χ2檢驗(yàn)；計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較行t檢驗(yàn)。采用Cox回歸分析氯吡格雷干預(yù)后冠心病PCI術(shù)患者出現(xiàn)CLR的獨(dú)立影響因素，P＜0.05時為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組一般資料比較CLR組膽固醇水平顯著低于NCLR組（P＜0.05），體質(zhì)指數(shù)＞25 kg/m2、2型糖尿病所占比例明顯高于NCLR組（P＜0.05），其他一般資料較NCLR組無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05，表2）。

表1 PCR引物設(shè)計

2.2 基因分型結(jié)果比較164例患者中CYP2C19*2位點(diǎn)三種基因型G/G、G/A、A/A分別占48.78%、38.41%、12.81%，等位基因G、A頻率分別為68.29%、31.71%；CYP2C19*3位點(diǎn)三種基因型G/G、G/A、A/A分別占93.90%、2.44%、3.66%，等位基因G、A頻率分別為95.43%、4.57%（表3）。

2.3 兩組CYP2C19＊2、CYP2C19＊3的基因型和等位基因頻率分布比較CLR組CYP2C19*2位點(diǎn)

表2 兩組一般資料比較

注：BMI：體質(zhì)指數(shù)；CCB：鈣通道阻滯劑；ACEI：血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑；ARB：血管緊張素受體拮抗劑G/A、A/A基因型頻率與A等位基因頻率顯著高于NCLR組（P＜0.05），G/G基因型與G等位基因頻率較NCLR組無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；CLR組CYP2C19*3位點(diǎn)各基因型和等位基因頻率分布較NCLR組無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05，表4）。

表3 基因分型結(jié)果比較

表4 兩組*2、*3位點(diǎn)基因型和等位基因頻率分布比較

表5 冠心病PCI術(shù)患者CLR危險因素Cox回歸分析

2.4 冠心病PCI術(shù)患者CLR危險因素Cox回歸分析 以冠心病PCI術(shù)患者氯吡格雷干預(yù)后CLR為因變量，將上述有差異的單因素納入多因素分析模型，攜帶*2位點(diǎn)基因，賦值1分，否則賦值0分；合并2型糖尿病，賦值1分，否則賦值0分；體質(zhì)指數(shù)＞25 kg/m2，賦值1分，否賦值0分；膽固醇超標(biāo)，賦值1分，否則賦值0分。經(jīng)Cox回歸分析，結(jié)果顯示CYP2C19*2位點(diǎn)基因多態(tài)性、體重指數(shù)＞25 kg/m2、2型糖尿病是冠心病PCI術(shù)患者CLR的獨(dú)立影響因素（P＜0.05，表5）。

3 討論

氯吡格雷為噻吩吡啶類抗血小板藥，屬于無活性藥物前體，可通過腸道吸收、肝臟細(xì)胞色素P450 酶系統(tǒng)代謝形成活性代謝產(chǎn)物，選擇性不可逆地結(jié)合血小板膜表面ADP受體P2Y12轉(zhuǎn)變成二硫鍵，對纖維蛋白原與GPⅡb/Ⅲa受體的結(jié)合具有間接抑制作用，最終實(shí)現(xiàn)血小板聚集抑制[6]。

目前國內(nèi)外關(guān)于CLR的定義尚缺乏統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，可能是由于血小板聚集率檢測方法不一致，故多為經(jīng)驗(yàn)性概念，主要包括臨床低反應(yīng)與實(shí)驗(yàn)室低反應(yīng)[7]。本文研究中，主要以實(shí)驗(yàn)室低反應(yīng)為觀測指標(biāo)。國外文獻(xiàn)報道冠心病PCI術(shù)患者接受氯吡格雷干預(yù)后CLR發(fā)生率達(dá)4%～31%[8,9]。但張文斌等[10]研究發(fā)現(xiàn)CLR發(fā)生率高達(dá)62.5%左右。本研究中，164例冠心病患者CLR發(fā)生率為37.80%，與上述報道結(jié)論存在一定差異，可能是由于患者個體差異、檢測方法、判定標(biāo)準(zhǔn)等因素所致。冠心病患者對氯吡格雷反應(yīng)存在明顯的個體差異，若部分患者血小板未充分抑制，則會增加血小板聚集率，形成CLR，可推測支架內(nèi)血栓等心血管事件的復(fù)發(fā)對患者臨床預(yù)后會造成一定影響[11]。

目前，在氯吡格雷代謝轉(zhuǎn)化環(huán)節(jié)，關(guān)于CYP2C19基因多態(tài)性研究報道較少。氯吡格雷需經(jīng)歷兩個步驟實(shí)現(xiàn)氧化代謝最終才能形成活性代謝產(chǎn)物，一是轉(zhuǎn)化為2-氧基-氯吡格雷，在CYP2C19、CYP1A2、CYP2B6催化作用下完成；二是轉(zhuǎn)化為活性代謝產(chǎn)物，基于CYP3A4、CYP2B6、CYP2C19、CYP2C9誘導(dǎo)催化前提下完成。在氧化過程中，于CYP2C19編碼下CYP2C19酶蛋白介導(dǎo)率占65%[12]。氯吡格雷是否轉(zhuǎn)化形成活性代謝產(chǎn)物與CYP2C19基因多態(tài)性密切相關(guān)。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)164例患者中CYP2C19*2位點(diǎn)三種基因型（G/G、G/A、A/A）與等位基因G、A頻率分別占48.78%、38.41%、12.81%、68.29%、31.71%，CYP2C19*3位點(diǎn)三種基因型（G/G、G/A、A/A）與等位基因G、A頻率依次為93.90%、2.44%、3.66%、95.43%、4.57%，與鄧濟(jì)甦等[13]研究數(shù)據(jù)吻合。CYP2C19*2處于10號染色體第5個外顯子681位點(diǎn)，屬于堿基變異（G→A），促使m RNA閱讀框架改變，導(dǎo)致翻譯過程中形成錯誤剪接位點(diǎn)，出現(xiàn)1個截短無功能酶蛋白；CYP2C19*3處于10號染色體第4個外顯子636位點(diǎn)，亦為堿基變異（G→A），誘導(dǎo)終止密碼提前形成，提前終止了酶蛋白合成，誘導(dǎo)酶活性喪失[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，CLR組CYP2C19*2位點(diǎn)G/G基因型與G等位基因頻率較NCLR組無明顯變化，CYP2C19*3位點(diǎn)各基因型和等位基因頻率分布較NCLR組無明顯變化，而CLR組CYP2C19*2位點(diǎn)G/A、A/A基因型頻率與A等位基因頻率顯著高于NCLR組，這與任志亮等[15]研究結(jié)論吻合。

此外，本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)Cox回歸分析，結(jié)果顯示CYP2C19*2位點(diǎn)基因多態(tài)性、體質(zhì)指數(shù)＞25 kg/m2、2型糖尿病是冠心病PCI術(shù)患者CLR的獨(dú)立影響因素。究其原因，肥胖患者體內(nèi)凝血因子活性較高，一定程度上會導(dǎo)致血小板聚集率增加，心臟疾病發(fā)生率高；而2型糖尿病患者由于伴有血管內(nèi)皮損傷，自身血小板P2Y12受體功能下降，誘發(fā)了活性氧/氮族應(yīng)激，引起血小板聚集功能亢進(jìn)，導(dǎo)致出現(xiàn)抗血小板藥物抵抗，心血管事件發(fā)生率高。研究證實(shí)氯吡格雷抗血小板聚集效果減弱與CYP2C19*2等位基因變異密切相關(guān)[16]。Kupstyte等表示大約30%的患者攜帶≥1個CYP2C19*2等位基因，血漿中氯吡格雷活性代謝產(chǎn)物水平低于非攜帶者，證實(shí)CYP2C19基因多態(tài)性是CLR關(guān)鍵預(yù)測因子。

本研究雖證實(shí)CYP2C19*2基因突變、體重指數(shù)＞25 kg/m2、2型糖尿病是氯吡格雷干預(yù)后冠心病PCI術(shù)患者出現(xiàn)CLR的獨(dú)立危險因素，但選取樣本量較小，可能存在抽樣誤差，再加上未進(jìn)行隨訪，總體情況不能預(yù)知。同時，未涉及大量遺傳變異及其相互作用是否會影響臨床結(jié)果，且未行阿司匹林抵抗調(diào)查，故今后研究中需擴(kuò)大樣本量，深入挖掘各方面的證據(jù)，進(jìn)一步驗(yàn)證本次研究結(jié)果的可信度。綜上，冠心病PCI術(shù)患者CLR危險因素包括CYP2C19*2基因突變、體重指數(shù)＞25 kg/m2、2型糖尿病，臨床應(yīng)給予足夠重視。