馬麗霞，傅廣，黃樹斌，石順華，湯華

冠狀動脈粥樣硬化性心臟病（CAD）是由各種因素所致的冠狀動脈粥樣硬化，引起動脈管腔狹窄或阻塞，出現(xiàn)心肌缺血缺氧性壞死的心臟病，也可由冠狀動脈（冠脈）痙攣所致，具有高發(fā)病率、高復(fù)發(fā)率及高死亡率等特點，且其發(fā)病逐漸趨于年輕化，已成為21世紀人類面臨的“第一健康殺手”[1]。由于其影響因素眾多，臨床研究難度比較大[2]。近年來，對CAD診治已取得長足進展，經(jīng)皮冠脈內(nèi)血管成形術(shù)等介入手術(shù)技術(shù)成熟，使其治療療效得到顯著提升。但研究表明，對持續(xù)心肌梗死及存在復(fù)雜病變患者，即使介入治療后仍無法完全恢復(fù)其正常血運，后期易出現(xiàn)復(fù)發(fā)，極大影響其預(yù)后質(zhì)量。而有效的側(cè)支循環(huán)建立，是促進缺血心肌血供恢復(fù)，挽救瀕臨壞死心肌以及提高預(yù)后質(zhì)量的關(guān)鍵[3]。新血管生成是側(cè)支循環(huán)建立的首要關(guān)鍵環(huán)節(jié)，血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）是體內(nèi)重要的促血管生成因子，能特異性促進血管內(nèi)皮生成和修復(fù)，在新血管生成過程中起中心調(diào)控作用[4]。研究發(fā)現(xiàn)，不同患者冠脈側(cè)支循環(huán)的建立有差異且受多種因素影響，但遺傳因素越來越受到國內(nèi)外學者的重視，目前，國際上已有相關(guān)血管生成相關(guān)基因的多態(tài)性研究，且得到了肯定的數(shù)據(jù)[5]。而國內(nèi)從基因水平探討冠脈側(cè)支循環(huán)建立的研究比較少，尤其基于VEGF-A基因多態(tài)性報道甚少，因此本研究就對此課題展開報道，旨在為CAD臨床診治提供指導(dǎo)。

1 資料與方法

1.1 研究對象選取長沙市第一醫(yī)院心血管內(nèi)科于2015年10月～2017年8月間收治的冠心病住院患者200例為研究對象，納入標準[6]：①均符合2012年中國心臟病協(xié)會制定的冠心病診斷標準，且經(jīng)冠脈造影檢查證實；②無合并嚴重的腦血管、肝腎肺等實質(zhì)性臟器組織疾??；③均自愿參加本次研究且簽署知情同意書。排除標準：①合并先天性心臟病、心肌炎等其他心臟疾病；②合并慢性炎癥、結(jié)締組織疾病；③合并肺動脈栓塞、主動脈夾層等動脈疾??；④合并嚴重創(chuàng)傷或惡性腫瘤。采用rentrop分級法將其分為無側(cè)支循環(huán)組和有側(cè)支循環(huán)組，分別為113例、87例，兩組患者在性別、年齡、吸煙率等一般資料和危險因素比較均無明顯差異（P＞0.05），故具可比性。

1.2 方法

1.2.1 冠狀動脈造影采用Seldinger法進行股動脈穿刺，同時Judkin法進行選擇性左、右冠狀動脈造影，選取Ph111ps數(shù)字減影X光機對冠脈進行多角度投照，明確冠脈狹窄位置及程度。左冠狀動脈和右冠脈分別至少行6個和2個以上體位投影。CAD評價標準：以主要冠脈或是主要分支管腔內(nèi)徑狹窄程度大于50.0%。

1.2.2 側(cè)支循環(huán)評定采用選擇性冠狀動脈造影確診為冠心病患者，其血管造影錄像需再次經(jīng)2位心內(nèi)科介入醫(yī)師采用盲法進行獨立復(fù)核，包括對其側(cè)支循環(huán)來源、走形及閉塞血管遠端充盈等情況進行觀察。對其側(cè)支循環(huán)按Rentrop分級系統(tǒng)進行評級，分為 0級、1級、2級、3級。其中，0級側(cè)支血管緩慢充盈，隱約顯像，造影劑充盈和排出時間均明顯延長，側(cè)支血管直徑＜1 mm，為無側(cè)支循環(huán)組；1-3級側(cè)支血管迅速顯影，側(cè)支血管顯影清楚，造影劑充盈和排出時間接近正常，側(cè)支血管直徑＞1 mm，為有側(cè)支循環(huán)組。如評價出現(xiàn)分歧，應(yīng)由3位醫(yī)師最終進行判斷。

1.2.3 血液DNA提取用EDTA抗凝血抽取所有研究對象外周血3 ml，混勻后于冰水中放置0.5 h，2000 rpm離心10 min，去除上清，留管底白細胞，將白細胞打散后，加1 ml 1×細胞核裂解液（STE），打散細胞團、混勻，再加酶解混合液（含350 μl STE、150 μl 10% SDS和10 μl 20 mg/ml蛋白酶K）搖勻，至出現(xiàn)粘稠透明狀。37℃溫箱過夜或50℃ 3～4 h。加等體積飽和酚（或1/3體積的飽和NaCl），輕搖混勻10 min，室溫2000 rpm離心10 min，去除蛋白和SDS的沉淀。小心移上清至另一離心管（盡量避免吸取中間層），加等體積氯仿混勻5 min，室溫2000 rpm離心5 min。重復(fù)加等體積氯仿混勻5 min，室溫2000 rpm離心5 min。將上清移入另一離心管中，沿離心管壁向DNA溶液中加入2.5倍體積的無水乙醇，輕輕搖動離心管混和至體系完全均一，見白色絮狀DNA。用移液器吸頭挑出DNA沉淀，在新配制的70%乙醇洗二次，室溫干燥5 min，再將DNA溶于20～100 L TE中，測OD值[7]。

1.2.4 PCR實驗運用TaqMan SNP genotyping assays（Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA，USA）對血樣DNA進行Real-Time PCR設(shè)計，并在7500型ABI的PCR儀器上運行，最后數(shù)據(jù)保存分析。

1.2.5 VEGF-A基因多態(tài)性檢測采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性法（PCR-RFLP）技術(shù)，以外周血提取出的DNA為模板進行PCR擴增，引物序列正向：5，-ACTTCTGGGCTGT TCTCG-3，；反向：5，-TCCTCTTCCTTCTCT TCT TCC-3，。PCR反應(yīng)體系（50 μl）：基因組DNA約5 μl（400 ng），dTNP 0.4 μl（10 mmol/L），aqDNA聚合酶2U，10×PCR緩沖液約5 μl，正反向引物各0.5 μl（20 μmol/L），剩余由無菌去離子水補充。PCR反應(yīng)程序：首先95℃預(yù)變性5 min，隨后95℃30 s、56℃ 45 s、72℃ 1 min，共進行32個循環(huán)，再給予72℃延長5 min后，保存于4℃。取5 μl PCR擴增產(chǎn)物、10×酶切緩沖液及3 μl BsmFI限制性內(nèi)切酶及無菌去離子水進行混合，搖勻后置于38℃水浴鍋過夜，將酶切產(chǎn)物經(jīng)8%聚丙烯酰胺電泳，產(chǎn)物經(jīng)溴化乙錠染色，在紫外燈下直接讀取VEGF-A基因型。引物由北京閱微基因技術(shù)有限公司提供，aqDNA聚合酶由上海廣銳生物科技有限公司提供，PCR緩沖液由上海銘博生物科技有限公司提供。

1.3 觀察指標①比較兩組患者的一般資料和危險因素；②比較兩組患者的VEGF-A基因rs2010963和rs1570360位點中G等位基因頻率，rs699947位點中C等位基因頻率，rs3025039和rs833061位點中T等位基因頻率，以及各危險的基因型。

1.4 統(tǒng)計學方法數(shù)據(jù)總結(jié)并提出的均值、標準差和描述性統(tǒng)計百分比形式。并不是正常分布的連續(xù)數(shù)據(jù)分析采用Mann-Whitney U檢驗。分類數(shù)據(jù)之間的關(guān)聯(lián)進行評估使用 Fisher或卡方檢驗，Hardy Weinberg檢驗評估采用卡方檢驗。使用STATA 11.2 軟件進行統(tǒng)計分析。SNPStats軟件用于計算連鎖不平衡。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1兩組患者的一般資料和危險因素比較兩組患者性別、年齡、病程、家族史、吸煙率、空腹血糖、收縮壓（SBP）、舒張壓（DBP）、總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）及空腹血糖（FBG）等一般資料和危險因素比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）（表1）。

表1 兩組患者的一般資料和危險因素比較

2.2 兩組患者的VEGF-A基因各位點基因型及基因頻率比較有側(cè)支循環(huán)組的VEGF-A基因rs2010963位點及rs1570360位點的GG基因型比例和G基因頻率均高于無側(cè)支循環(huán)組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；VEGF-A基因rs699947位點的CC基因型比例和C基因頻率均高于無側(cè)支循環(huán)組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；rs3025039位點和rs833061位點的TT基因型比例和T基因頻率均明顯高于無側(cè)支循環(huán)組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（表2～6）。

3 討論

CAD是一種臨床常見的心血管疾病，具有高發(fā)病率、高致殘率、高死亡率、高復(fù)發(fā)率及多并發(fā)癥等“四高一多”特點，被認為是21世紀人類健康的“頭號殺手”。研究證實[8]，CAD患者冠脈持續(xù)狹窄或堵塞，導(dǎo)致局部心肌缺血、缺氧甚至壞死，除可發(fā)生心絞痛、心肌梗死外，尚可導(dǎo)致各類心律失常、心臟擴大、心力衰竭及猝死等嚴重不良心血管事件，嚴重威脅患者的生命健康。早診斷、早治療是提高CAD治療及預(yù)后療效的關(guān)鍵。近年來研究發(fā)現(xiàn)，冠脈側(cè)支循環(huán)建立對CAD患者預(yù)后具有積極影響，而在尸體解剖中發(fā)現(xiàn)，CAD患者普遍存在側(cè)支循環(huán)現(xiàn)象，且較正常心臟側(cè)支循環(huán)建立更為豐富。研究證實，當冠脈狹窄程度到一定范圍時，冠脈側(cè)支循環(huán)血流會明顯增加，以代替正常冠脈血流，起到心臟保護作用，有助于減輕心肌缺血缺氧性壞死程度，降低心絞痛、心肌梗死、心力衰竭等不良心血管事件風險，并能為溶栓及介入治療提供條件，具有重要的臨床意義。但臨床研究表明[9]，冠脈側(cè)支循環(huán)在不同患者中存在著顯著差異，且受多種因素影響，因此明確其影響因素對促進冠脈側(cè)支循環(huán)建立有著重要作用。目前研究表明，冠脈狹窄程度是側(cè)支循環(huán)建立的獨立影響因素，冠脈血管閉塞遠端壓力降低，當兩支冠脈達到足夠壓力差梯度時，即可促進血流經(jīng)潛在吻合口形成有意義的側(cè)支循環(huán)，是其首要的促動因素。高血壓、吸煙史是冠脈狹窄的重要危險因素，有學者指出[10]，其同樣為側(cè)支循環(huán)建立的促進因素，其中高血壓促進機制可分為①高血壓可促進左室壁厚度增加，使冠脈吻合口及側(cè)支循環(huán)官腔增大；②高血壓可提高冠脈與冠脈竇以及冠脈與狹窄血管遠端間的壓力差，促進冠脈間小動脈開放形成側(cè)支循環(huán)，而關(guān)于吸煙與側(cè)支循環(huán)建立目前尚無確切定論。同時自然狀態(tài)下血管新生速度較冠脈狹窄速度緩慢，因此“治療性血管新生”觀念也隨之出現(xiàn)，即采用藥物、轉(zhuǎn)基因等治療手段，加快缺血心肌內(nèi)新血管形成，甚至建立有效的側(cè)支循環(huán)，最終促進心肌供血供氧恢復(fù)，減輕心肌損害。

表2 兩組患者的VEGF-A基因rs2010963位點基因型及基因頻率比較（n，%）

表3 兩組患者的VEGF-A基因rs1570360位點基因型及基因頻率比較（n，%）

表4 兩組患者的VEGF-A基因rs699947位點基因型及基因頻率比較（n，%）

表5 兩組患者的VEGF-A基因rs3025039位點基因型及基因頻率比較（n，%）

表6 兩組患者的VEGF-A基因rs833061位點基因型及基因頻率比較（n，%）

目前，在血清學層面對CAD患者側(cè)支循環(huán)形成調(diào)控的研究，國內(nèi)已開展諸多，比如血清脂聯(lián)素水平升高，可改善內(nèi)皮細胞功能，促進冠脈血管重建，生長分化因子15（GDF-15）、骨橋蛋白可促進冠脈側(cè)支循環(huán)形成，基本已得到臨床證實。多項研究證實[11]，CAD患者受冠脈狹窄引起心肌缺血、缺氧應(yīng)激時，可刺激多種細胞因子分泌，對損失后炎性反應(yīng)和組織修復(fù)起著重要作用，其中血管內(nèi)皮細胞與循環(huán)中單核細胞相互作用，導(dǎo)致大量血管生成因子表達，促進新血管生成及側(cè)支循環(huán)建立。VEGF是目前公認的重要促血管生長因子，同時也是重要的促血管通透因子，最早于1989年在牛腦垂體濾泡星狀細胞中提取出，分子質(zhì)量約為45 000，由內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞及巨噬細胞等細胞分泌，在炎癥、缺氧、生長因子等因素刺激時分泌可明顯增加。研究證實[12]，VEGF可直接作用于內(nèi)皮細胞特異性有絲分裂原，促進血管內(nèi)皮細胞分裂、增殖，是正常機體及病理狀態(tài)下重要的新血管生成調(diào)節(jié)因子，同時參與缺血、炎癥、腫瘤以及多種血管變性疾病發(fā)生發(fā)展。目前，基于VEGF與CAD發(fā)生及治療轉(zhuǎn)歸報道較多，其可通過多種機制參與CAD發(fā)生發(fā)展，其中VEGF可促進新血管生成以及側(cè)支循環(huán)建立，有助于緩解心肌缺血缺氧狀態(tài)，縮小心肌梗死面積，且VEGF表達越高側(cè)支循環(huán)發(fā)生率也越高。CAD患者側(cè)支循環(huán)建立雖受多種因素影響，但近年來遺傳因素關(guān)注度逐漸上升，且國外大量數(shù)據(jù)證實相關(guān)血管生成基因多態(tài)性與側(cè)支循環(huán)建立密切相關(guān)，諸如GDF-15基因-3148C/G位點、肝細胞生長因子（HGF）基因C57488A位點與側(cè)支循環(huán)均有著密切關(guān)系。時強等[13]研究顯示，血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（ACE）I/D多態(tài)性中DD基因型和D基因是可影響CAD患者側(cè)支循環(huán)建立。但目前關(guān)于VEGF-A基因多態(tài)性與CAD側(cè)支循環(huán)建立相關(guān)性國內(nèi)尚無大量報道，何皓等[14]研究顯示，VEGF+450C/G基因多態(tài)性與CAD發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，其中CC基因型和C基因可能是冠心病血管病變的易感基因。本研究筆者在排除血壓、吸煙等因素對側(cè)支循環(huán)建立影響后，進行VEGF-A基因多態(tài)性檢測。結(jié)果顯示，有側(cè)支循環(huán)組患者的VEGF-A基因rs2010963位點和rs1570360位點的GG基因型比例和G基因頻率均明顯高于無側(cè)支循環(huán)組（P＜0.05），rs699947位點的CC基因型比例和C基因頻率均明顯高于無側(cè)支循環(huán)組（P＜0.05），rs3025039位點和rs833061位點的TT基因型比例和T基因頻率均明顯高于無側(cè)支循環(huán)組（P＜0.05），提示VEGF-A基因多態(tài)性與CAD患者側(cè)支循環(huán)建立密切相關(guān)，考慮其原因可能與各位點G、C、T等等位基因缺失，導(dǎo)致VEGF-A基因調(diào)控區(qū)變異，降低啟動子和VEGF-A基因轉(zhuǎn)錄活性，降低血液中VEGF-A合成，從而影響側(cè)支循環(huán)建立[15]。

綜上所述，CAD患者的VEGF-A基因多態(tài)性與側(cè)支循環(huán)形成有關(guān)，VEGF-A基因rs2010963和rs1570360位點中G等位基因，rs699947位點中C等位基因，rs3025039和rs833061位點中T等位基因，可能是CAD患者側(cè)支循環(huán)形成的促進因素。