苗常青，盧群，劉平，白玲，馬愛群

急性心肌梗死（AMI）是冠狀動脈粥樣硬化性心臟病（冠心病，CAD）分型中最嚴重的一種危急重癥，致死率較高，嚴重威脅人民生命健康，加重社會負擔。研究顯示，AMI的發(fā)生、發(fā)展涉及多個方面因素，包括遺傳因素、環(huán)境因素等[1]，動脈粥樣硬化易損斑塊引起的血管內(nèi)皮細胞損傷和慢性炎癥反應(yīng)被公認為是CAD重要的病理基礎(chǔ)[2]。針對AMI相關(guān)遺傳易感基因的研究，是目前心血管領(lǐng)域研究的熱點，對于高危易感人群早期篩查和及早干預(yù)，降低其發(fā)病風(fēng)險具有重要的臨床價值。很多實驗結(jié)果證實炎性細胞因子存在單核苷酸多態(tài)性（SNPs），從而造成基因易感性不同，有可能是影響炎癥發(fā)生、動脈粥樣硬化（AS）及血栓形成等的重要因素，導(dǎo)致AMI的發(fā)生[3]。脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2（Lp-PLA2）屬于磷脂酶超家族成員之一，與血小板活化密切相關(guān)，被認為是CAD發(fā)病的獨立危險因素[4]。國外有遺傳學(xué)研究證實Lp-PLA2主要受基因因素的調(diào)控，尤其是PLA2G7多個位點的基因突變會明顯影響Lp-PLA2的活性，影響CAD的發(fā)病風(fēng)險[5]；但由于存在地域和種族差異，關(guān)于PLA2G7與CAD之間的關(guān)系一直存有爭議。通過采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性（PCR-FRLP）的檢測方法，對在西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院收治的AMI患者及正常對照組人群的Lp-PLA2 rs1051931、rs1805017、rs16874954位點基因多態(tài)性進行檢測，以期發(fā)現(xiàn)AMI的遺傳危險因素以及探討遺傳基因與AMI發(fā)病的相關(guān)性，為臨床治療提供科學(xué)理論依據(jù)，現(xiàn)報告如下：

1 資料與方法

1.1 研究對象本項研究選取2017年1月～2018年2月于西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科和急診科就診的176例AMI住院患者作為AMI組，年齡為37～83歲，平均年齡（58.46±11.72）歲，男性102例，女性74例。納入標準：①所有患者均行心電圖、冠狀動脈造影（CAG）、心肌酶譜檢查確診為AMI；②符合中華醫(yī)學(xué)會心血管病學(xué)分會關(guān)于AMI的診斷標準[6]：根據(jù)CAG證實至少1支冠狀動脈（冠脈）分支狹窄≥50%；③漢族，在本地居住20年以上者。排除標準：①不符合上述納入標準者；②合并心肌病、風(fēng)濕性心臟病、主動脈夾層等心臟疾病者；③合并家族性高膽固醇血癥、嚴重肝腎功能不全、自身免疫性疾病、腫瘤和急性或嚴重慢性感染性疾病者；④相互間有血緣關(guān)系者；⑤精神障礙不能合作者。另外選取同時期在我院健康體檢中心進行體格檢查的健康受試者191例作為對照組，年齡為26～86歲，平均年齡為（57.30±13.29）歲，包括男性106例，女性85例。對照組受試對象均為漢族，本地居住20年以上。本項研究獲得我院倫理委員會的批準以及受試者或家屬的知情同意。

1.2 方法

1.2.1 基線數(shù)據(jù)收集由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科醫(yī)護人員以現(xiàn)場調(diào)查的方式，發(fā)放調(diào)查問卷并當場回收，以收集受試者的一般臨床資料，包括民族、婚姻狀況、文化程度、吸煙、飲酒、居住地、飲食習(xí)慣、疾病和用藥史等。

1.2.2 標本采集采集患者空腹肘靜脈血兩份各5 ml，一份置于EDTA抗凝管中，離心，取上清，置于-80℃保存?zhèn)溆?，用于DNA提??；一份用于檢測生化指標。

1.2.3 血清DNA提?、偃?00 μl血液樣本置于1.5 ml EP管中，加入800 μl TBP緩沖液，混勻后，3000 rpm離心5 min，棄上清；②加入500 μl TBP緩沖液和10 μl蛋白酶K，置于55 ℃水浴鍋中孵育1 h；③振蕩15 s，充分混勻后，離心，取上清，加入260 μl無水乙醇，充分混勻；④將上述混合液置于含有DNeasy spin column柱的收集管中，離心，棄收集管中的液體；⑤將DNeasy spin column柱置于新的收集管中，加入500 μl AW1緩沖液，離心，棄收集管中的液體；重復(fù)該步驟一次；⑥將DNeasy spin column柱置于EP管中，加入200 μl AE緩沖液，離心，棄收集管中的液體；重復(fù)該步驟一次；⑦將提取的DNA進行瓊脂糖凝膠電泳，測定DNA濃度。

1.2.4 PCR-RFLP參照NCBI中Lp-PLA2位點信息使用Primer 5.0設(shè)計引物以包含目的位點，rs1805017位點（上游：5'-GAGCAGAGTAAAGA GAATAGTAA-3'；下游：5'-TGGGCTGAGGACT TAGCCTCTTTAAGCCTC-3'），rs16874954位點（上游：5'-CAAGTAACTGGGATTACAGGCACAT G-3'；下游：5'-CTTTACCTATATCATCCAGGTG-3'）；rs1051931（上游：5'-TCAAGATACCAAG CAAGAACAAGA-3'；下游：5'-GGATGTAAAGC AGCAAAATTGA-3'）。25 μl反應(yīng)體系：1.5 μl MgCl2+2.5 μl 10×緩沖液+2.5 μl dNTP +1 μl DNA模板+各2 μl上下游引物+0.5 U Taq DNA酶+適量ddH2O 95 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃ 30 s，58 ℃30 s，72 ℃ 30 s，40個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。進行瓊脂糖凝膠電泳，回收瓊脂糖凝膠靶條帶。采用ABI3730XL測序檢測分析。

1.3 觀察指標采用Beckman AU5821全自動生化分析儀（Beckman coulter 公司，美國）檢測受試者入院24 h內(nèi)血清總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、高密度脂蛋白-膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白-膽固醇（LDL-C）等部分血脂指標。血脂異常：TC＞5.72 mmol/L，TG＞1.70 mmol/L，HDL-C＜1.0 mmol/L，LDL-C＞3.64 mmol/L；或依靠服用降脂藥維持正常血脂水平。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析本資料采用SPSS 18.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行處理，各組間差異比較采用方差分析?；蛐突虻任换蛟诓煌纸M之間的分布比較采用卡方檢驗，用單因素二元Logistic回歸分析，來分析影響AMI發(fā)生的風(fēng)險因素，篩選P＜0.05的變量，以這些因素為自變量，AMI發(fā)生為因變量進行非條件多因素二元Logistic回歸分析。最后的結(jié)果用優(yōu)勢比（OR）及95%置信區(qū)間（CI）來表示。OR＞1表示該因素為危險因素，OR＜1表示該因素為保護因素。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組受試者一般臨床資料分析AMI組患者TC、TG、LDL-C水平明顯高于對照組，而HDL-C水平低于對照組，另外有糖尿病史者、高血壓史者的比例明顯高于對照組受試者（P＜0.05，表1）。

2.2 Hard-weinberg平衡檢驗Lp-PLA2基因rs1805017、rs16874954、rs1051931位點在對照人群中的基因分型符合Hard-weinberg平衡規(guī)律（rs1805017：χ2＝0.120，P＝0.730；rs16874954：χ2＝1.11，P＝0.293；rs1051931：χ2＝2.79，P＝0.095），表明對照人群的基因型分布可反映整體人群基因的分布情況。

2.3 Lp-PLA2基因rs1805017、rs16874954、rs1051931位點SNP分析rs1805017位點位于Lp-PLA2基因的第4外顯子，含兩個等位基因：92R（野生型）和92H（變異型），從而形成3種基因型：純合子92RR、92HH和雜合子92RH。rs16874954位點位于Lp-PLA2基因的第9外顯子，含兩個等位基因：279V（野生型）和279F（變異型），從而形成3種基因型：純合子279VV、279FF和雜合子279VF。rs1051931位點位于Lp-PLA2基因的第11外顯子，含兩個等位基因：379A（野生型）和379V（變異型），從而形成3種基因型：純合子379AA、379VV和雜合子379AV。研究發(fā)現(xiàn)，測序結(jié)果都為單峰的是純合基因型，AMI組患者和對照組患者中Lp-PLA2基因rs1805017位點GG、GA、AA基因頻率和rs16874954位點CC、AC基因頻率存在統(tǒng)計學(xué)差異，P＜0.05。而兩組受試對象rs1051931位點SNP組間比較無明顯差異（P＞0.05，表2）。

表1 兩組受試者一般臨床資料比較

2.4 AMI患者Lp-PLA2基因rs1805017、rs16874954位點SNP與血脂指標的關(guān)系分析深入分析Lp-PLA2基因rs1805017、rs16874954 SNP與AMI患者血脂水平的相關(guān)性，結(jié)果顯示，rs1805017位點GA+AA基因型患者HDL-C水平明顯低于GG基因型患者（P＜0.05）；而rs16874954位點AC基因型患者TG水平明顯高于CC基因型患者（P＜0.05）；其余血脂水平在不同基因型患者之間并無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05，表3）。

2.5 AMI易感性的單因素二元Logisitic回歸分析對AMI患者Lp-PLA2基因rs1805017、rs16874954、rs1051931位點分別進行單因素二元Logisitic回歸分析，結(jié)果顯示，rs1805017、rs16874954位點SNP與AMI發(fā)病密切相關(guān)（P＜0.05，表4）。

2.6 AMI易感性的多因素二元Logisitic回歸分析在單因素分析的基礎(chǔ)上，進一步進行多因素Logistic分析，以AMI（無＝0，有＝1）作為因變量，篩選P＜0.05的因素作為自變量，結(jié)果顯示，rs1805017位點突變與AMI易感性密切相關(guān)，但是rs16874954位點SNP與AMI發(fā)病未見相關(guān)性，提示rs1805017位點多態(tài)性可能是AMI發(fā)病的獨立保護因素，而rs16874954位點突變可能與環(huán)境因素協(xié)調(diào)致病，同時，還發(fā)現(xiàn)HDL-C是AMI發(fā)病的獨立危險因素（表5）。

3 討論

目前大量研究已經(jīng)證實血管內(nèi)皮炎癥反應(yīng)和遺傳因素都在AMI的發(fā)病過程中發(fā)揮了重要作用。動脈粥樣硬化易損斑塊破裂可引發(fā)血管內(nèi)膜損傷和炎性因子大量釋放，造成血管管腔狹窄或阻塞，引起心肌供血不足，嚴重者可致急性心肌梗死[7]。隨著分子生物學(xué)和分子遺傳學(xué)的不斷進展，人們對AMI的發(fā)病機理也有了更深的理解，許多研究表明，大量炎性細胞因子與心血管疾病尤其是動脈粥樣硬化的發(fā)生與發(fā)展密切相關(guān)[8]，因此，對炎性細胞因子及其基因多態(tài)性和AMI發(fā)病相關(guān)性的研究具有重要的臨床價值。

Lp-PLA2是由血管內(nèi)膜浸潤的巨噬細胞和淋巴細胞合成并分泌的一種磷脂酶超家族成員之一，大部分與LDL-C結(jié)合，少部分與HDL-C結(jié)合，通過水解氧化磷脂生成溶血磷脂膽堿和氧化非酯化脂肪酸，誘發(fā)慢性炎癥反應(yīng)的發(fā)生[9-11]。近幾年新研發(fā)的Lp-PLA2抑制劑darapladib，已經(jīng)被證實具有減少壞死的脂質(zhì)中心面積以及巨噬細胞和泡沫細胞數(shù)量，使血管內(nèi)易損斑塊趨于穩(wěn)定[12]，但目前關(guān)于darapladib的三期臨床研究結(jié)果并未顯示出明顯的改善主要觀察終點作用[13]。有遺傳學(xué)研究證實，Lp-PLA2的活性與基因因素密切相關(guān)，尤其是PLA2G7多個位點的基因突變會明顯影響Lp-PLA2的活性，從而影響CAD的發(fā)病風(fēng)險[14]；但關(guān)于PLA2G7與CAD之間的關(guān)系一直存有爭議。我們主要探討西安地區(qū)rs1805017、rs16874954、rs1051931這三個位點的基因多態(tài)性。

表2 Lp-PLA2基因rs1805017、rs16874954位點SNP分析（n，%）

表3 AMI患者Lp-PLA2基因rs1805017、rs16874954位點SNP與血脂水平相關(guān)性分析

表4 Lp-PLA2基因多態(tài)性位點與AMI易感性單因素分析

表5 Lp-PLA2基因多態(tài)性位點與AMI易感性多因素二元Logistic回歸分析

日本學(xué)者首先發(fā)現(xiàn)Lp-PLA2基因rs16874954位點SNP是亞洲人群CAD發(fā)病的重要危險因素，并認為高加索人不具有此位點SNP[15]；Iona Y Millwood等[16]學(xué)者經(jīng)研究證實中國漢族人群V279F位點基因突變可顯著降低Lp-PLA2的活性，加大冠脈病變風(fēng)險。杜克大學(xué)醫(yī)學(xué)中心通過一項大型研究顯示，rs1805017、rs1051931位點的基因?qū)儆诜峭x突變，與CAD的發(fā)生有明顯的相關(guān)性，但是這兩個位點基因在CAD患者人群中的分布是降低的[17]。本項研究結(jié)果顯示，西安地區(qū)人群中rs1805017、rs16874954、rs1051931三個位點主要存在92RR、92HH和雜合子92RH基因型、純合子279VV和雜合子279VF基因型、純合子379AA、379VV和雜合子379AV基因型。AMI人群中rs1805017位點GG型以及rs16874954位點CC型基因頻率較健康對照人群明顯降低；而兩組受試人群rs1051931位點的基因型分布頻率未見統(tǒng)計學(xué)差異，P＞0.05。在此基礎(chǔ)上，筆者又進一步分析了不同基因型AMI患者血脂水平的差異。rs1805017位點GA+AA基因型患者TG水平高于GG基因型患者，而HDL-C水平明顯低于GG基因型患者；rs16874954位點AC基因型患者TG水平明顯高于CC基因型患者；其余血脂水平在不同基因型患者之間并無統(tǒng)計學(xué)差異。這也說明了rs1805017、rs16874954位點的基因多態(tài)性影響AMI患者的血脂水平，提示這部分基因分型可作為高膽固醇血癥人群AMI發(fā)病風(fēng)險的預(yù)測指標。通過單因素分析，rs1805017、rs16874954位點SNP與AMI發(fā)病密切相關(guān)；調(diào)整患者血脂水平、糖尿病史、高血壓史等因素后，rs1805017位點SNP仍然與AMI易感性密切相關(guān)，但是rs16874954位點SNP與AMI發(fā)病未見相關(guān)性；提示rs1805017位點多態(tài)性可能是AMI發(fā)病的獨立保護因素，而rs16874954位點突變可能與環(huán)境因素協(xié)調(diào)致病。

綜上所述，本項研究首次發(fā)現(xiàn)西安地區(qū)人群Lp-PLA2基因rs1805017、rs16874954多態(tài)性位點與急性心肌梗死的發(fā)生有關(guān)，而rs1051931位點SNP與AMI的發(fā)生可能無直接相關(guān)性。雖然結(jié)果與國內(nèi)外部分研究結(jié)果不一致，據(jù)推測可能是由于樣本量偏少、存在種族和地區(qū)差異性等因素的影響，但是也從基因水平間接說明Lp-PLA2基因突變可能對AMI患者血脂水平有一定的影響，建議存在Lp-PLA2基因位點突變的人群注意控制血脂水平，以降低急性心肌梗死的發(fā)病風(fēng)險。