1.衢州職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)院，浙江 衢州 324000；2.浙江醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校，浙江 寧波 315100

乳腺癌是全球女性中最常見的腫瘤之一，其發(fā)病率居女性腫瘤之首，現(xiàn)已經(jīng)成為影響女性健康最主要的原因[1]。據(jù)統(tǒng)計，2012年全球乳腺癌新增病例數(shù)約有167萬，占所有腫瘤的25%[2]。在中國女性當(dāng)中，每年乳腺癌新增病例和死亡病例分別占到全世界的 12.2%和9.6%[3]，所以乳腺癌的診斷和治療顯得尤為重要。目前乳腺癌最常見的治療手段為手術(shù)、放化療、內(nèi)分泌和靶向藥物治療，但是由于乳腺癌自身特點(diǎn)術(shù)后易引起復(fù)發(fā)且大多數(shù)藥物會產(chǎn)生極大的副作用和耐藥[4-5]，尋求新的、高效低毒的治療乳腺癌的藥物變得尤為重要。

中藥在綜合治療癌癥方面取得了良好的療效，越來越受到相關(guān)研究者的關(guān)注[6]。白首烏為蘿藦科鵝絨藤屬植物耳葉牛皮消(Cynanchum auriculatum Royle ex Wight)的干燥塊根，是傳統(tǒng)的補(bǔ)益中藥。中醫(yī)理論認(rèn)為，白首烏具有補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨、黑須發(fā)及延年益壽等功效，藥理研究表明，白首烏具有抗衰老、抗炎、抗腫瘤、增強(qiáng)免疫、保肝等活性。白首烏的主要活性成分為C21甾體苷類化合物，許多研究表明其具有良好的抗腫瘤活性[7-10]。而告達(dá)庭(Caudatin)為C21甾體苷元，可從白首烏中分離得到。據(jù)研究報道，告達(dá)庭對人胃癌、肝癌、肺癌等多種腫瘤均具有明顯的抑制作用[11-13]。在生物體中告達(dá)庭主要以糖苷的形式存在，本研究在前人研究基礎(chǔ)上，探討告達(dá)庭衍生物，告達(dá)庭-3-O-β-D-加拿大麻糖苷(告達(dá)庭-3-O-β-D-吡喃磁麻糖苷，caudatin-3-O-β-D- cymaropyranoside)，對人乳腺癌細(xì)胞抗腫瘤活性及相關(guān)的作用機(jī)制。

1 儀器與材料

1.1 細(xì)胞株 人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231和MCF-7購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。

1.2 藥物 告達(dá)庭-3-O-β-D-加拿大麻糖苷(Ca-G)自制，取耳葉牛皮消的塊根，粉碎,80%乙醇溶液滲漉提取，減壓濃縮成浸膏。加水混懸，用乙酸乙酯萃取，濃縮萃取液，進(jìn)行硅膠柱色譜分離，以氯仿-甲醇(體積比80∶1→5∶1)梯度洗脫，流分經(jīng)硅膠柱色譜和HPLC制備，得Ca-G，純度>98%，配制成10 mg/ml的母液，溶劑為DMSO，于-20 ℃分裝保存。

1.3 試劑 胎牛血清、DMEM培養(yǎng)液購自美國Invitrogen公司；DMSO、MTT購自美國Sigma公司；BCA 蛋白濃度測定試劑盒，、PI/RNase細(xì)胞周期檢測試劑盒、Annexin-V-FITC/7AAD細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自碧云天公司；anti-cyclin D1、anti-β-tubulin購自美國Cell Signaling Technology公司；horseradish peroxidase conjugated secondary antibodies (二抗)購自美國Bio-Rad公司。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231，MCF-7培養(yǎng)于完全DMEM培養(yǎng)基中(含10%胎牛血清)，于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞呈貼壁生長，密度達(dá)90%左右時進(jìn)行傳代。

2.2 MTT法測定細(xì)胞活力 收集對數(shù)生長期的MDA-MB-231，MCF-7細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化并離心后，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，以3×103個/孔的密度接種于96孔培養(yǎng)板，每孔100 μL。置于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞貼壁完全后，加入不同濃度的Ca-G，濃度梯度設(shè)置為1、20、40、80 μg/mL，另外設(shè)置溶劑對照組(不加藥，加入DMSO)和空白調(diào)零組(只加培養(yǎng)液、不加細(xì)胞和藥物)，均設(shè)4個復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng) 48 h后，每孔加入5 mg/mL MTT溶液20 μL，孵育4 h，吸凈孔內(nèi)液體，每孔加入150 μL的DMSO，震蕩10 min，使藍(lán)紫色結(jié)晶物甲瓚充分溶解，用酶標(biāo)儀于570 nm處測各孔吸光度(OD)值，并計算相對細(xì)胞存活率。相對細(xì)胞存活率(%) =(給藥孔-空白調(diào)零孔/對照孔-空白調(diào)零孔)×100%。

2.3 細(xì)胞周期 收集對數(shù)生長期的MDA-MB-231，MCF-7細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化并離心后，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，接種于6 cm的培養(yǎng)皿中，細(xì)胞密度為6×105個/皿，置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁完全后，加入不同濃度的Ca-G(0、15、30 μg/mL)，培養(yǎng)箱中孵育48 h后，收集各組細(xì)胞，消化，離心，每組加入1 mL的PBS用來洗滌細(xì)胞，并用70%乙醇進(jìn)行固定，置于-20 ℃過夜。取出固定好的細(xì)胞懸液用PBS洗滌細(xì)胞兩次，按照PI/RNase細(xì)胞周期檢測試劑盒說明書進(jìn)行操作，每1×106個細(xì)胞沉淀中加入500 μL的PI/RNase染液，避光，染色15 min。染色完成后，上機(jī)檢測實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用flowjo軟件進(jìn)行分析處理。

2.4 細(xì)胞凋亡 收集對數(shù)生長期的MDA-MB-231，MCF-7細(xì)胞，接種于6 cm的培養(yǎng)皿中，細(xì)胞密度為6×105個/皿，置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁完全后，加入不同濃度的Ca-G(0、15、30 μg/mL)，培養(yǎng)箱中孵育48 h后，收集各組細(xì)胞，經(jīng)PBS洗滌后，按照Annexin-V-FITC/7AAD細(xì)胞凋亡檢測試劑盒說明書進(jìn)行操作，每1×106個細(xì)胞沉淀中加入500 μL的PI/RNase染液，避光，染色15 min。染色完成后，上機(jī)檢測實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用flowjo軟件進(jìn)行分析處理。

2.5 Western blotting 收集對數(shù)生長期的MDA-MB-231，MCF-7細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化并離心后，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，接種于6 cm的培養(yǎng)皿中，細(xì)胞密度為6×105/皿，置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁完全后，加入不同濃度的Ca-G(0、15、30 μg/mL)，培養(yǎng)箱中孵育48 h后，收集各組細(xì)胞。加入適量RIPA裂解液裂解。按照碧云天BCA蛋白含量測定試劑盒說明書檢測樣品蛋白含量，按BIO-RAD說明書方法配制分離膠，濃縮膠，上樣，進(jìn)行SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜，封閉，孵育一抗，過夜。并加入二抗，按照ECL顯影液試劑盒說明書，放入化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)，曝光。

3 結(jié)果

3.1 Ca-G對乳腺癌細(xì)胞活力的影響 MTT結(jié)果顯示不同濃度的Ca-G給藥48 h后，加藥組乳腺癌細(xì)胞株的活力均明顯降低，且呈一定的劑量依賴性(P<0.001)。如圖1所示。

3.2 Ca-G對細(xì)胞周期的影響 由于Ca-G對MDA-MB-231，MCF-7細(xì)胞的生長具有顯著的抑制作用，且細(xì)胞周期阻滯是影響細(xì)胞生長進(jìn)程的關(guān)鍵因素之一。推測Ca-G可能對細(xì)胞周期具有調(diào)節(jié)作用，因此采用流式細(xì)胞術(shù)檢測了Ca-G對細(xì)胞周期的影響。Ca-G作用MDA-MB-231，MCF-7細(xì)胞48 h后，G1期細(xì)胞數(shù)量顯著增加，而 G2期細(xì)胞數(shù)目則減少，說明Ca-G可使乳腺癌細(xì)胞阻滯于細(xì)胞周期G1期。見圖2、表1。

MDA-MB-231 MCF-7 Ca-G G1SG2G1SG20μg/mL47.52±0.7218.23±0.4634.25±0.2855.82±0.5426.23±0.3917.95±0.1615μg/mL58.46±1.08***25.58±0.9415.96±2.0063.31±1.00***21.86±0.8114.83±1.4530μg/mL62.92±0.30***24.25±0.5112.63±0.8175.13±0.60***12.52±0.4612.34±0.68

3.3 Ca-G對細(xì)胞周期關(guān)鍵蛋白表達(dá)水平的影響 cyclin D1可推動細(xì)胞周期由G1時期進(jìn)入到S時期，在細(xì)胞周期G1期起到關(guān)鍵作用，所以本研究檢測了cyclin D1蛋白表達(dá)。Ca-G能夠明顯下調(diào)乳腺癌細(xì)胞中cyclin D1的蛋白表達(dá)水平，說明Ca-G可能是通過抑制cyclin D1的表達(dá)引起乳腺癌細(xì)胞阻滯于細(xì)胞周期G1期。如圖3所示。

3.4 Ca-G對細(xì)胞凋亡的影響 除細(xì)胞周期外，細(xì)胞凋亡也是抗腫瘤藥物常見的作用機(jī)制之一。推測Ca-G可能對細(xì)胞凋亡具有調(diào)節(jié)作用，并采用流式細(xì)胞術(shù)檢測了Ca-G對細(xì)胞凋亡的影響。Ca-G作用MDA-MB-231，MCF-7細(xì)胞48 h后，Ca-G呈劑量依賴性地引起MDA-MB-231，MCF-7細(xì)胞凋亡比例升高，在劑量為30 μg/ml時，凋亡比例分別為(MDA-MB-231)和(MCF-7)，說明Ca-G一定程度誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞產(chǎn)生凋亡。見圖4、表2。

表2 Ca-G對乳腺癌細(xì)胞凋亡的影響

MDA-MB-231 MCF-7 Ca-G正常細(xì)胞凋亡細(xì)胞死亡細(xì)胞正常細(xì)胞凋亡細(xì)胞死亡細(xì)胞0μg/mL98.94±0.760.71±0.340.35±0.5394.57±0.870.12±0.045.31±0.8715μg/mL91.75±1.277.74±0.95***0.51±0.7587.16±3.1212.31±2.80***0.53±0.4430μg/mL60.91±2.0337.41±1.33***1.68±0.7152.22±2.8645.78±1.96***2.00±0.97

3.5 Ca-G對細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響 研究表明caspase蛋白被激活是細(xì)胞凋亡產(chǎn)生的標(biāo)志性事件。凋亡起始者caspase9/8被激活后，進(jìn)一步激活下游凋亡執(zhí)行蛋白如caspase3/7等，最終導(dǎo)致凋亡。本研究檢測了Ca-G作用后caspase相關(guān)蛋白的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)caspase 9, caspase 7表達(dá)升高。說明Ca-G誘導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞凋亡可能是通過激活caspase信號通路。如見圖5所示。

4 討論

中藥因其不易產(chǎn)生耐藥、毒副作用低等優(yōu)點(diǎn)，在治療癌癥方面越來越受到研究者的青睞，許多用于臨床的藥物，如紫杉醇、羥基喜樹堿等都是直接或間接來源于中藥[14-16]。白首烏中C21甾體苷在體內(nèi)外研究中，均具有良好的抑制腫瘤作用，告達(dá)庭作為其中一種苷元也起到一定抗腫瘤作用，但是其含量較低。告達(dá)庭-3-O-β-D-加拿大麻糖苷(Ca-G)是以告達(dá)庭為苷元形成的一種糖苷類化合物。很少報道其是否具有抗腫瘤作用。本研究通過MTT實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Ca-G能夠劑量依賴性地抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖。

腫瘤細(xì)胞最常見的特點(diǎn)是迅速、無限增殖。細(xì)胞周期調(diào)控紊亂是腫瘤細(xì)胞異常增殖最常見且最基本的機(jī)制之一，為了檢測Ca-G抑制乳腺癌細(xì)胞增殖是否和細(xì)胞周期的調(diào)控有關(guān)，本研究采用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Ca-G作用后G0/G1期細(xì)胞數(shù)明顯增多，說明Ca-G可誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞阻滯于細(xì)胞周期G0/G1期。細(xì)胞周期是由大量細(xì)胞周期調(diào)控蛋白參與的復(fù)雜過程。其中cyclin D1是調(diào)控細(xì)胞周期G1期的關(guān)鍵蛋白，可通過結(jié)合并激活細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶，促使G1期向S期的轉(zhuǎn)變[17]。本研究結(jié)果表明，Ca-G能夠抑制MDA-MB-231和MCF-7細(xì)胞內(nèi)cyclin D1 的表達(dá)，可能與阻滯細(xì)胞周期G0/G1期相關(guān)。

細(xì)胞凋亡也是抗腫瘤藥物常見的作用機(jī)制之一，為了檢測Ca-G抑制乳腺癌細(xì)胞增殖是否和細(xì)胞凋亡有關(guān)，本研究采用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Ca-G作用乳腺癌細(xì)胞后，細(xì)胞凋亡比例明顯升高。研究表明caspase蛋白被激活往往是細(xì)胞凋亡產(chǎn)生的標(biāo)志性事件。文獻(xiàn)報道，有兩條經(jīng)典的依賴caspase信號通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，分別是死亡受體介導(dǎo)的外源性途徑和線粒體介導(dǎo)的內(nèi)源性途徑。無論是通過外源性或內(nèi)源性途徑，目的都是通過激活凋亡起始者caspase 9或caspase 8，進(jìn)一步激活下游凋亡執(zhí)行蛋白如caspase 3或caspase 7等，最終導(dǎo)致凋亡[18-19]。有文獻(xiàn)報道在乳腺癌MCF-7細(xì)胞中不表達(dá)caspase 3[20]，所以本研究檢測了caspase 7代替caspase 3。結(jié)果發(fā)現(xiàn)caspase 9、 caspase7表達(dá)均升高，說明Ca-G通過激活內(nèi)外兩條途徑，激活caspase信號通路，導(dǎo)致三陰性乳腺癌細(xì)胞凋亡總之，告達(dá)庭-3-O-β-D-加拿大麻糖苷可有效抑制乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231和MCF-7的增殖活性，其機(jī)制可能與細(xì)胞周期阻滯和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān)。這為告達(dá)庭及其衍生物抗腫瘤作用的進(jìn)一步研究提供一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，也為綜合開發(fā)C21甾體苷類化合物的臨床應(yīng)用提供一種思路。