鐘靈允， 曾佳恒， 劉 巧， 汪 丹，符 佳， 楊 林， 陳沁涵， 趙江林

(1.成都大學 醫(yī)學院， 四川 成都 610106；2.成都大學 農(nóng)業(yè)部雜糧加工重點實驗室， 四川 成都 610106)

0 引 言

植物揮發(fā)油屬于植物的次生代謝產(chǎn)物，大多來源于植物的莖、葉、花、果實、種子以及表皮等部位，可以通過物理壓榨、水蒸氣蒸餾、溶劑提取等方式收集提煉得到[1].研究表明，植物揮發(fā)油主要為萜類化合物、脂肪族化合物、芳香族化合物以及其他含氮硫類化合物等，其中萜類化合物為植物揮發(fā)油的主要組成成分[2].研究發(fā)現(xiàn)，植物揮發(fā)油具有抗菌消炎、抗病毒、抗氧化以及保護心血管等藥理作用[3-4]，其一直也是食品、醫(yī)藥以及農(nóng)業(yè)環(huán)保等多個領(lǐng)域的研究熱點[5].

野菊為菊科多年生草本植物，廣泛分布于我國東北、華北、華中、華南及西南各地[6].野菊以全草入藥，具有清熱解毒、疏風散熱、明目降壓等功效，可以用于預防和治療感冒、肝炎、癰癤等疾病[7].野菊花為野菊的頭狀花序部分，是入藥主要部位，常用于提取分離藥效成分.目前對野菊花揮發(fā)油的研究多集中在其揮發(fā)性成分的分析檢測方面，對野菊花揮發(fā)油抗菌活性方面的研究相對較少.對此，本研究以野菊花為材料，提取其揮發(fā)性成分，同時采用不同抗菌活性檢測模型測定野菊花揮發(fā)油對細菌和真菌的抑制活性，擬為野菊花揮發(fā)油的進一步開發(fā)利用提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材 料

實驗所用材料包括：硫酸鏈霉素、多菌靈，購自Sigma公司；甲醇、氯化鈉、無水乙醇、葡萄糖、氫氧化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、氯化鉀、牛肉膏、蛋白胨、瓊脂等試劑均為分析純，購自成都市科龍化工試劑公司；野菊花購自成都荷花池中藥材市場.

1.2 菌 株

1)細菌.白色葡萄球菌(ATCC 8799)、表皮葡萄球菌(ATCC 35984)、金黃葡萄球菌(ATCC 6538)、鼠傷寒沙門氏菌(CMCC 50115)、大腸桿菌(ATCC 25922)，由成都大學醫(yī)學院提供.

2)真菌.蕎麥立枯絲核菌，由成都大學農(nóng)業(yè)部雜糧加工重點實驗室提供.

1.3 培養(yǎng)基

1)馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(Potato dextrose agar，PDA)用于真菌培養(yǎng)及活性測定，其配方為：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂粉15 g，加去離子水定容至1 000 mL.

2)營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(Nutrient broth，NB)用于細菌的活化及活性測定，其配方為：氯化鈉5 g，牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，加去離子水定容至1 000 mL，pH值調(diào)節(jié)至7.4.

1.4 儀 器

1.5 方 法

1.5.1 野菊花揮發(fā)油的提取.

野菊花于50 ℃低溫烘干，粉碎，采用水蒸氣蒸餾法提取其揮發(fā)性成分.稱取一定量的野菊花干粉，按照料水比為1∶10(m/v)的比例，在微沸狀態(tài)下提取野菊花揮發(fā)油，每次持續(xù)5～6 h.收集揮發(fā)油，往其中加入少許無水硫酸鈉，干燥，除去干燥劑后避光低溫保存，總共提取2 kg野菊花干樣，稱重計算揮發(fā)油得率.

1.5.2 野菊花揮發(fā)油的氣相色譜—質(zhì)譜(GC-MS)分析.

1)色譜條件.色譜柱為毛細管柱，載氣為高純度氦氣，進樣口溫度為290 ℃，壓力49.5 kPa，總流量24.0 mL/min，流速1.0 mL/min，線速度36.1 cm/s.

2)升溫程序.初設(shè)溫度40 ℃，保持5 min；以10 ℃/min 升至150 ℃，保持5 min；以5 ℃/min升至225 ℃，保持5 min；以5 ℃/min 升至250 ℃，保持2 min；以10 ℃ /min 升至300 ℃，保持15 min；分流比為20∶1；檢樣器溫度220 ℃.

3)質(zhì)譜條件.EI(70 eV)，離子源溫度為200 ℃，掃描范圍為33～700 m/z.

1.5.3 野菊花揮發(fā)油對細菌的抑制活性.

1)揮發(fā)油溶液的配制.稱取一定量的野菊花揮發(fā)油，溶于30%二甲基亞砜(DMSO)溶液中，配成初始濃度范圍在6.25～100 mg/mL的系列溶液，4 ℃低溫保存，待測.

2)細菌活化.用接種環(huán)挑取少量菌種，接種到50 mL營養(yǎng)肉湯中，于37 ℃下培養(yǎng)24～36 h，用麥氏比濁管調(diào)節(jié)細菌濃度至108CFU/mL.

3)利用微量稀釋法測定揮發(fā)油對細菌的抑制活性[8].吸取1 mL上述菌液于新鮮的50 mL營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，震蕩搖勻，在潔凈96孔板中加入90 μL營養(yǎng)肉湯和10 μL樣品溶液，每個濃度重復4次，30% DMSO為陰性對照，硫酸鏈霉素為陽性對照.

4)在37 ℃下，培養(yǎng)24～36 h后，用肉眼觀察細菌生長情況，判斷最低抑制濃度(MIC)值，即無細菌生長的孔所對應的揮發(fā)油濃度為MIC值.在確定樣品的MIC基礎(chǔ)上，從MIC值所對應的無菌生長的孔以及比MIC濃度更高的孔中各吸取20 μL培養(yǎng)液，接種于瓊脂平板上，用三角玻璃涂布鏟輕輕平推，使液體均勻分布，隨后將平皿置于37 ℃培養(yǎng)24～36 h，觀察有無細菌生長，以培養(yǎng)皿中計數(shù)少于5個菌落作為藥物的最低殺菌濃度(MBC).

1.5.4 野菊花揮發(fā)油對蕎麥立枯絲核菌的抑制活性.

1)樣品溶液的配制.準確吸取一定量的揮發(fā)油置于潔凈離心管中，用12.5% DMSO溶液依次稀釋，使揮發(fā)油初始濃度范圍在5～40 mg/mL，每個濃度溶液體積均為1 mL.陽性對照為多菌靈，陰性對照為12.5% DMSO.

2)真菌活化.用接種針挑取蕎麥立枯絲核菌菌絲，接種至新鮮的PDA平板中央，25 ℃暗培養(yǎng)2～3 d，待其菌絲剛好長滿平板.

3)利用帶毒平板法測定揮發(fā)油對立枯絲核菌的抑制活性[9].將PDA培養(yǎng)基加熱融化，待其溫度降至40～50 ℃時，將1 mL樣品溶液加入裝有49 mL PDA培養(yǎng)基的三角瓶中，搖勻，每個三角瓶倒3個平板，靜置.培養(yǎng)基凝固后，用無菌打孔器在上述長滿立枯絲核菌的平板上打孔，然后用接種針挑取菌餅接種到已凝固的培養(yǎng)基上，用封口膜將培養(yǎng)皿封口，于28 ℃下培養(yǎng)，48 h后，采用十字交叉法測量菌落的直徑，記錄數(shù)據(jù)并計算相對抑制率.

4)數(shù)據(jù)統(tǒng)計.以供試樣品終濃度對數(shù)為橫坐標，抑制率換算成幾率值為縱坐標，求回歸方程(Y=aX+b)，并計算抑制中濃度IC50值.

2 結(jié)果與討論

2.1 野菊花揮發(fā)油主要成分分析

實驗采用水蒸氣蒸餾法提取干燥的野菊頭狀花序，收集得到淺藍色的野菊花揮發(fā)油成分，其具有野菊花的特殊香味，干燥后稱重計算揮發(fā)油得率為0.32 %(w/w).經(jīng)GC-MS分析比對后，共鑒定出36種成分，主要為萜類化合物及其含氧衍生物以及脂肪族化合物，具體結(jié)果見表1.

由表1可知，相對含量較高的5種成分為姜黃烯(11.37%)、氧化石竹烯(10.53%)、胡椒酮(8.96%)、α-Copaen-11-ol(7.73%)和(S)-順式馬鞭草烯醇(6.39%)，其占總成分相對含量的44.98%.此外，左旋樟腦、左旋龍腦、α-松油醇、石竹烯、桉油烯醇、巴倫西亞橘烯等化合物的相對含量均在1%以上.

表1 野菊花揮發(fā)油化學成分

2.2 野菊花揮發(fā)油對細菌的抑制活性

本研究采用微量肉湯稀釋法測定了野菊花揮發(fā)油對5種臨床常見致病細菌的抑菌活性，結(jié)果如表2所示.

表2數(shù)據(jù)顯示，在供試濃度范圍下，野菊花揮發(fā)油對3株革蘭氏陽性葡萄球菌和2株革蘭氏陰性腸道桿菌的生長均表現(xiàn)出了一定抑制活性.總體而言，野菊花揮發(fā)油對革蘭氏陽性球菌的抑制能力稍強于陰性腸道桿菌，對白色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的抑制活性相對較好，其MIC值均為1.25 mg/mL，MBC值為2.5 mg/mL，對金黃色葡萄球菌的抑制活性稍弱，MIC值為2 mg/mL，MBC值為2.5 mg/mL.野菊花揮發(fā)油對鼠傷寒沙門氏菌的MIC和MBC值分別為2.5 mg/mL和5 mg/mL，其對大腸桿菌的MIC和MBC值分別為5 mg/mL和10 mg/mL.

表2 野菊花揮發(fā)油對細菌的抑制活性

2.3 野菊花揮發(fā)油對立枯絲核菌的抑制活性

本研究采用帶毒平板法測定了野菊花揮發(fā)油對蕎麥立枯絲核菌的抑制活性，結(jié)果如圖1所示.

圖1野菊花揮發(fā)油對蕎麥立枯絲核菌生長的抑制作用

圖1結(jié)果顯示，野菊花揮發(fā)油對立枯絲核菌菌絲生長具有很好的抑制作用，且隨著濃度增加，抑制作用隨之增強，并呈現(xiàn)出一定的量效關(guān)系.在設(shè)定終濃度為0.024 mg/mL條件下，野菊花揮發(fā)油對蕎麥立枯絲核菌的抑制率超過50%，而濃度為0.096 mg/mL時，其對蕎麥立枯絲核病菌菌絲生長的抑制率高達80%.在此基礎(chǔ)之上，進一步測定了野菊花揮發(fā)油對立枯絲核菌的抑制中濃度，其IC50值為0.02 mg/mL(回歸方程Y=1.7191X+1.3794).

3 結(jié) 論

野菊為多年生草本藥用植物，在我國的分布較為廣泛.本研究采用水蒸氣蒸餾法提取制備了野菊花中的揮發(fā)性成分，并采用氣相色譜—質(zhì)譜(GC-MS)聯(lián)用的方法對野菊花揮發(fā)性成分進行了分析鑒定.研究表明，野菊花揮發(fā)油的主要成分為萜類及其衍生物，其相對含量高于10%的成分主要為姜黃烯和氧化石竹烯.此外，胡椒酮、左旋樟腦、α-Copaen-11-ol、(S)-順式馬鞭草烯醇、左旋龍腦、α-松油醇、石竹烯、桉油烯醇和巴倫西亞橘烯等18個化合物的相對含量也在1%以上.同時，本研究采用不同的抗菌活性檢測模型測定了野菊花揮發(fā)油的抑菌活性，結(jié)果表明，野菊花揮發(fā)油對3種革蘭氏陽性葡萄球菌和2種革蘭氏陰性桿菌均表現(xiàn)出了一定的抑制作用，其中揮發(fā)油對白色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的抑制活性相對較好，其MIC值僅為1.25 mg/mL，充分展現(xiàn)出了野菊花揮發(fā)油在醫(yī)藥領(lǐng)域有著較好的應用潛力.此外，本研究首次報道了野菊花揮發(fā)油對蕎麥立枯絲核菌的抑制活性，其抑制中濃度IC50值低至0.02 mg/mL，表現(xiàn)出了較好的開發(fā)利用價值，可為蕎麥立枯病等病害新型防治藥劑的研制提供新的思路.