伍蕊嗣， 劉 濤， 梁 悅， 周蔚昕， 寇 強(qiáng)， 張 佳

(成都大學(xué) 藥學(xué)與生物工程學(xué)院， 四川 成都 610106)

0 引 言

白術(shù)為菊科植物白術(shù)的干燥根莖，主要含揮發(fā)油、內(nèi)酯類和多糖類成分，具有健脾益氣、燥濕利水等功能，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，主產(chǎn)于浙江、安徽、淮北、皖南等地[1].《中國藥典》2015年版一部中白術(shù)項(xiàng)下無含量測定項(xiàng)，難以體現(xiàn)和保障白術(shù)的內(nèi)在品質(zhì)及其相關(guān)制劑的質(zhì)量[2].目前雖已有以多個成分同步測定或利用液相指紋圖譜來控制白術(shù)質(zhì)量的相關(guān)報(bào)道，但由于化學(xué)對照品緊缺、價格昂貴且不穩(wěn)定，而利用指紋圖譜無法定量測定白術(shù)含量，這些都限制了這些質(zhì)控模式的實(shí)際應(yīng)用[3-6].此前，有學(xué)者提出一測多評法，即只采用一個對照品實(shí)現(xiàn)對藥材多種成分含量的同步測定[7-9].因該法具有代表性而被《中國藥典》2015 年版一部收載，并在丹參、人參、黃連等藥材中得到應(yīng)用.基于此，本研究擬采用一測多評法，以白術(shù)內(nèi)酯I、白術(shù)內(nèi)酯III和蒼術(shù)酮多個有效成分為指標(biāo)對白術(shù)飲片進(jìn)行多成分含量測定，利用一個白術(shù)內(nèi)酯III為對照品，通過相對校正因子的計(jì)算，同步實(shí)現(xiàn)多成分(白術(shù)內(nèi)酯I、蒼術(shù)酮)的含量測定，擬為白術(shù)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的可控提供技術(shù)保障.

1 材料與儀器

1.1 材 料

1)實(shí)驗(yàn)所用白術(shù)為本實(shí)驗(yàn)室2017年從浙江、四川、河北購買的13批栽培品，樣品經(jīng)成都大學(xué)藥學(xué)與工程學(xué)院劉濤研究員鑒定為菊科植物白術(shù)的干燥根莖.

2)實(shí)驗(yàn)所用的試劑包括：白術(shù)內(nèi)酯I(批號，wkq16052904，純度≥98%)、白術(shù)內(nèi)酯III(批號，wkq16092604，純度≥98%)，購自四川省維克奇生物科技有限公司；蒼術(shù)酮(批號，170107，純度為85%，計(jì)算時按100%折算)，購自成都植標(biāo)化純生物技術(shù)有限公司.實(shí)驗(yàn)所用甲醇、乙腈為色譜純，水為怡寶純凈水，其余試劑均為分析純.

1.2 儀 器

實(shí)驗(yàn)所用儀器包括：P230Ⅱ型高效液相色譜儀、Ichrom 5100型高效液相色譜儀(大連依利特分析儀器有限公司)；FA2004型分析電子天平(上海良平儀器儀表有限公司)；HS-3120型超聲波清洗器(昆山超聲儀器有限公司).

2 方法與結(jié)果

2.1 方法學(xué)考察

2.1.1 色譜條件.

本研究參照相關(guān)文獻(xiàn)對白術(shù)飲片一測多評法的色譜條件(流動相、檢測波長)進(jìn)行了考察，最終確定實(shí)驗(yàn)的色譜條件為：依利特Supersil C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相為乙腈(A)—水溶液(B)；梯度洗脫程序?yàn)椋?～20 min，62% A，20～21 min，62%～80% A，21～40 min，80% A，40～41 min，80%～62% A，41～50 min，62% A；流速1.0 mL/min，柱溫30 ℃，檢測波長220 nm，進(jìn)樣量10 μL.在以上色譜條件下，蒼術(shù)酮、白術(shù)內(nèi)酯I、白術(shù)內(nèi)酯III分離度良好，結(jié)果如圖1所示.

1.白術(shù)內(nèi)酯III； 2.白術(shù)內(nèi)酯I； 3.蒼術(shù)酮

圖1對照品(A)和供試品(B)的高效液相色譜圖

2.1.2 混合對照品溶液的制備.

精密稱定蒼術(shù)酮、白術(shù)內(nèi)酯I、白術(shù)內(nèi)酯III對照品適量，加甲醇溶解，并定容至刻度，搖勻，配制成濃度分別為0.6848 mg/mL、0.8488 mg/mL及0.6343 mg/mL的單一對照品溶液.

精密吸取以上3種對照品溶液，加甲醇定容至刻度，搖勻，配制成濃度分別為0.0240 mg/mL、0.0170 mg/mL及0.1097 mg/mL的混合對照品溶液.

精密吸取1.0 mL混合對照品溶液4份，分別置于5、10、25、50 mL容量瓶中，加甲醇定容搖勻，依次作為混合對照品溶液2～5.

2.1.3 供試品溶液的制備.

取白術(shù)粉末(過2號篩)約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇40 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理10 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，作為供試品溶液.

2.1.4 線性關(guān)系考察.

取“2.1.2"項(xiàng)下 5 個濃度梯度的混合對照品溶液，按照“2.1.1"項(xiàng)下的色譜條件.對峰面積(Y)和進(jìn)樣量(X)進(jìn)行線性回歸，分別得到蒼術(shù)酮、白術(shù)內(nèi)酯I、白術(shù)內(nèi)酯III的回歸方程及線性范圍(見表1).結(jié)果表明，混合對照品溶液在各自線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好.

表1 白術(shù)飲片中3個成分的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.1.5 精密度.

按照“2.1.1"項(xiàng)下的色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣混合對照品溶液2號6次，蒼術(shù)酮、白術(shù)內(nèi)酯I和白術(shù)內(nèi)酯III峰面積的RSD分別為0.93%、2.42%、1.37%.結(jié)果表明，儀器的精密度良好.

2.1.6 穩(wěn)定性.

按照“2.1.3"項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，于樣品制備后的第0、2、4、6、8、12 h，在“2.1.1"項(xiàng)的色譜條件下進(jìn)行測定，蒼術(shù)酮、白術(shù)內(nèi)酯I和白術(shù)內(nèi)酯III峰面積的RSD分別為4.78%、4.77%、4.70%.結(jié)果表明，供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好.

2.1.7 重復(fù)性.

按照“2.1.3"項(xiàng)下的方法平行制備6份供試品溶液，在“2.1.1"項(xiàng)的色譜條件下進(jìn)行測定，蒼術(shù)酮、白術(shù)內(nèi)酯I和白術(shù)內(nèi)酯III含量的RSD分別為1.70%、3.32%、1.70%.結(jié)果表明，方法的重復(fù)性良好.

2.1.8 加樣回收.

取已知含量的白術(shù)粉末(過二號篩)約0.25 g，精密稱定，按含量—對照品(1∶1) 的比例分別加入3種對照品溶液適量，按照“2.1.3"項(xiàng)下的方法平行制備6份供試品溶液，在“2.1.1"項(xiàng)的色譜條件下進(jìn)行測定，蒼術(shù)酮、白術(shù)內(nèi)酯I和白術(shù)內(nèi)酯III的加樣回收率分別為105.22%、104.60%、94.92%，含量的RSD分別為1.45%、2.44%、4.59%.結(jié)果表明，方法的回收率良好.

表2 加樣回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2 相對校正因子確定

依據(jù)相關(guān)計(jì)算公式，分別計(jì)算白術(shù)內(nèi)酯I和蒼術(shù)酮相對于白術(shù)內(nèi)酯III(內(nèi)參物)的相對校正因子，結(jié)果見表3.

表3 白術(shù)飲片中3個成分相對校正因子

2.3 白術(shù)飲片一測多評法的適應(yīng)性評價

2.3.1 不同儀器的影響.

在同一實(shí)驗(yàn)室，采用同一色譜柱(依利特Supersil C18)，考察了2種高效液相色譜儀(P230II型、Ichrom 5100型)對相對校正因子的影響，結(jié)果見表4.數(shù)據(jù)顯示，f白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ/白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、f蒼術(shù)酮/白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ的RSD均小于5 %.結(jié)果表明，相對校正因子在這2種高效液相色譜儀下重復(fù)性良好.

表4 2種高效色譜儀測得相對校正因子

2.3.2 不同色譜柱的影響.

在同一實(shí)驗(yàn)室，采用2種高效液相色譜儀(P230II型、Ichrom 5100型)，分別考察了2種色譜柱(依利特Supersil C18、Global GS-120-5-C18-AP)對相對校正因子的影響，結(jié)果見表5、6.

表5 不同色譜柱測得相對校正因子——P230Ⅱ

表6 不同色譜柱測得相對校正因子——Ichrom 5100

表5、6數(shù)據(jù)顯示，f白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ/白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、f蒼術(shù)酮/白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ的RSD均小于2%.結(jié)果表明，相對校正因子在這2種高效液相色譜儀下2種色譜柱間的重現(xiàn)性良好.

2.3.3 不同柱溫的影響.

在同一實(shí)驗(yàn)室，采用同一色譜柱(依利特Supersil C18)，在同一高效液相色譜儀(Ichrom 5100型)下，考察3種柱溫(30、35、40 ℃)對相對校正因子的影響，結(jié)果見表7.

表7 不同柱溫對相對校正因子的影響

表7數(shù)據(jù)顯示，f白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ/白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、f蒼術(shù)酮/白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ的RSD均小于2%.結(jié)果表明，各成分相對校正因子重現(xiàn)性良好.

2.3.4 不同流速的影響.

在同一實(shí)驗(yàn)室，采用同一色譜柱(依利特Supersil C18)，在同一高效液相色譜儀(Ichrom 5100型)下，考察了3種流速(0.8、1.0、1.2 mL/min)對相對校正因子的影響，結(jié)果見表8.

表8 不同流速對相對校正因子的影響

表8數(shù)據(jù)顯示，f白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ/白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、f蒼術(shù)酮/白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ的RSD均小于3%.結(jié)果表明，各成分相對校正因子重現(xiàn)性良好.

2.4 一測多評法待測色譜峰的定位

在同一實(shí)驗(yàn)室，分別考察了2種高效液相色譜儀(P230Ⅱ型、Ichrom 5100型)，2種色譜柱(依利特Supersil C18、Global GS-120-5-C18-AP)下相對保留值和相對時間差的重現(xiàn)性，結(jié)果見表9、10.

表9 一測多評法待測成分色譜峰的定位(相對保留值)

表10 一測多評法待測成分色譜峰的定位(相對時間差)

表9、10數(shù)據(jù)顯示，相對保留值(RSD<2%)較相對時間差(RSD<4%)更能定位色譜峰.

2.5 一測多評法與外標(biāo)法測定結(jié)果的比較

按照“2.1.3"項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，在“2.1.1"項(xiàng)的色譜條件下，采用外標(biāo)法測得白術(shù)內(nèi)酯III的含量，再通過一測多評法與外標(biāo)法測得蒼術(shù)酮和白術(shù)內(nèi)酯I的含量，將兩種方法所得結(jié)果進(jìn)行比較，結(jié)果見表11.

表11 外標(biāo)法與一測多評法測定白術(shù)飲片中3種成分結(jié)果比較

由表11數(shù)據(jù)可見，在13批白術(shù)飲片中，2種方法所測得成分含量的RSD均小于5%.此表明，本研究建立的一測多評法能替代外標(biāo)法對白術(shù)飲片進(jìn)行含量控制.

3 討 論

白術(shù)作為臨床常用中藥，一直是行業(yè)研究的重點(diǎn)，而《中國藥典》2015年版一部中白術(shù)無含量測定項(xiàng)的收載.目前，還沒有發(fā)現(xiàn)對白術(shù)飲片利用一測多評法的報(bào)道，只有多成分同時測定和液相指紋圖譜的相關(guān)研究.但由于化學(xué)對照品緊缺和價格昂貴，指紋圖譜無法定量測定含量，限制了這些質(zhì)控模式的實(shí)際應(yīng)用.

蒼術(shù)酮、白術(shù)內(nèi)酯I、白術(shù)內(nèi)酯II、白術(shù)內(nèi)酯III是白術(shù)中的主要特征性成分，藥理活性顯著，且與白術(shù)的功效具有相關(guān)性，是評價白術(shù)飲片質(zhì)量的適宜指標(biāo).但本研究在實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ極不穩(wěn)定，其穩(wěn)定性和精密度均不能達(dá)到要求，故只對白術(shù)飲片中白術(shù)內(nèi)酯I、白術(shù)內(nèi)酯III、蒼術(shù)酮成分進(jìn)行一測多評法的研究，之所以選擇白術(shù)內(nèi)酯III作為內(nèi)參物是由于它在白術(shù)飲片中的含量高于白術(shù)內(nèi)酯I，而蒼術(shù)酮對照品難以制備且價格昂貴，故本實(shí)驗(yàn)選擇性質(zhì)穩(wěn)定且價格適中的白術(shù)內(nèi)酯III作為內(nèi)參物.本次實(shí)驗(yàn)中使用的蒼術(shù)酮對照品純度為85%，在實(shí)驗(yàn)過程中的含量按100%折算.

同時，本研究還對白術(shù)飲片一測多評法的供試品制備條件進(jìn)行了考察：溶媒(甲醇、95%乙醇、水)；溶媒倍數(shù)(20、40、80倍)；超聲時間(10、20、30 min)，以峰面積加權(quán)評分法確定了“2.1.3”項(xiàng)下的供試液制備方法.對不同的色譜條件進(jìn)行考察后確定了“2.1.1”項(xiàng)下的色譜條件，在該色譜條件下，各待測成分分離度良好，達(dá)到基線分離.

此外，本研究以白術(shù)內(nèi)酯III為內(nèi)參物，建立白術(shù)內(nèi)酯I、蒼術(shù)酮相對白術(shù)內(nèi)酯III的相對校正因子，先得到白術(shù)飲片中白術(shù)內(nèi)酯III的含量(外標(biāo)法)，進(jìn)而計(jì)算得到白術(shù)內(nèi)酯I、蒼術(shù)酮的含量(相對校正因子).通過對13批白術(shù)飲片的含量測定發(fā)現(xiàn)，一測多評法和外標(biāo)法兩法所得數(shù)值間RSD<5%.白術(shù)飲片一測多評法的準(zhǔn)確度、重復(fù)性、穩(wěn)定性及精密度均較好.相對保留值較相對時間差能更好地定位色譜峰，RSD<2%.另外，為了確定白術(shù)飲片一測多評法的適應(yīng)性，分別考察了2種高效色譜儀(P230II型、Ichrom 5100型)、2種型號色譜柱(依利特Supersil C18、Global GS-120-5-C18-AP)、3種柱溫(30、35、40 ℃)、3種流速(0.8、1.0、1.2 mL/min)對相對校正因子的影響.但由于實(shí)驗(yàn)條件的限制，沒有采用更多型號或類別的液相色譜儀和色譜柱進(jìn)行驗(yàn)證，耐用性和系統(tǒng)適應(yīng)性有待進(jìn)一步研究.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本研究建立的一測多評法可同時簡便快速準(zhǔn)確地測定白術(shù)飲片中主要及有效成分(蒼術(shù)酮、白術(shù)內(nèi)酯I、白術(shù)內(nèi)酯III)的含量，能用于白術(shù)飲片含量的控制.