丁駿 謝葉文 吳奇勇 潘潔 陳潔 寧永玲 戚春建

213004 南京醫(yī)科大學(xué)附屬常州市第二人民醫(yī)院中心實驗室(丁駿、謝葉文、潘潔、陳潔、寧永玲、戚春建)，心胸外科 (吳奇勇)

動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是一種常見的心血管疾病。AS的發(fā)病機制復(fù)雜，其中巨噬細(xì)胞吞噬氧化型低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein，ox-LDL)形成巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞，是AS形成和發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[1]。正常情況下，巨噬細(xì)胞包裹異物后會發(fā)生遷移，但巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞在清除脂質(zhì)后不離開病灶，且分泌更多的促炎因子，降解細(xì)胞外基質(zhì)，誘發(fā)細(xì)胞凋亡，促進斑塊的惡性演進及易損狀態(tài)的形成。因此，促進泡沫細(xì)胞外遷出病灶，將會極大促進AS治療策略的發(fā)展。而研究表明，巨噬細(xì)胞在脈管管壁的滯留性可被逆轉(zhuǎn)[2]。

β葡聚糖是一種天然多糖，具有抗炎、降糖、降血脂的作用。Lim等[3]研究發(fā)現(xiàn)β葡聚糖可降低高脂飲食倉鼠血清內(nèi)三酰甘油、總膽固醇及低密度脂蛋白，抑制腹主動脈和胸主動脈的粥樣硬化。我們研究發(fā)現(xiàn)[4]，β葡聚糖可明顯減弱ox-LDL誘導(dǎo)的丙二醇甲醚醋酸酯促分化的單核—巨噬細(xì)胞表面共刺激分子及炎癥因子的表達(dá)，并抑制人AS斑塊細(xì)胞的炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生。然而，β葡聚糖是否對泡沫細(xì)胞形成及遷移發(fā)揮作用，目前尚不明確。有研究發(fā)現(xiàn)，趨化因子受體7(chemokine receptor 7，CCR7)的表達(dá)在心血管疾病發(fā)生發(fā)展中存在差異性，提示CCR7可能參與其病理生理的過程[5]。本研究擬用ox-LDL誘導(dǎo)RAW264.7巨噬細(xì)胞為泡沫細(xì)胞的模型，并用β葡聚糖進行干預(yù)，通過觀察泡沫細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)的聚集、炎癥因子及趨化因子受體的表達(dá)和對CCL19/CCL21的趨化反應(yīng)性，評估β葡聚糖對巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞形成及遷移能力的影響，探討β葡聚糖在AS發(fā)生發(fā)展中的作用及相關(guān)機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

β葡聚糖由美國路易斯維爾大學(xué)嚴(yán)俊教授惠贈；ox-LDL(100 mg/ml)購自上海翊圣生物科技有限公司；RAW264.7巨噬細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫；小鼠重組CC趨化因子配體19 [recombinant mouse chemokine(C-C motif)ligand 19，rmCCL19]和rmCCL21購自Biolegend公司；抗小鼠的CCR1和CCR7抗體分別購自R&D Systems公司和Cell Signaling Technology公司；油紅O試劑購自美國Sigma公司；TRIzol試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR Green Mix購自Vazyme公司；胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、DMEM培養(yǎng)基、PBS購自Gibco公司；各目的基因的引物序列由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

復(fù)蘇RAW264.7巨噬細(xì)胞，放于含有100 ml/L FBS的DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液。用含有EDTA的0.25%胰酶消化傳代，細(xì)胞傳至第5代后，將其接種到六孔板中并隨機分為對照組、ox-LDL組(80 μg/ml ox-LDL孵育細(xì)胞)、β葡聚糖干預(yù)組(100 μg/ml β葡聚糖和80 μg/ml ox-LDL共同孵育細(xì)胞)。

1.3 油紅O染色

以上三組細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，小心吸棄培養(yǎng)液，PBS漂洗3次，4%多聚甲醛固定30 min，PBS輕柔洗2次；稀釋油紅儲存液，油紅∶去離子水=3∶2，濾紙過濾，室溫放置10 min；油紅O染色20 min，吸棄染液，用60%異丙醇漂洗細(xì)胞5 s，除去多余染液，PBS輕柔洗3次后顯微鏡下拍照。

1.4 熒光定量PCR

細(xì)胞孵育24 h后，收集細(xì)胞，采用TRIzol法提取細(xì)胞RNA，酶標(biāo)儀檢測其純度和濃度，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將其逆轉(zhuǎn)為cDNA。隨后在實時熒光定量PCR儀上進行目的片段擴增。PCR的反應(yīng)總體系參照說明書，上下游引物各0.4 μl、2 × SYBR Green Supermix 10 μl、cDNA模板2 μl，總共20 μl。以GAPDH作為內(nèi)參基因，每組樣品設(shè)3個復(fù)孔，各目的基因的上下游引物序列見表1。PCR的反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性10 s，60℃退火30 s，總共進行40個循環(huán)；溶解曲線設(shè)定為60℃(10 s)、95℃(10 s)。mRNA的相對表達(dá)量計算公式為2-ΔΔct法。

表1 實時定量PCR引物序列

1.5 流式細(xì)胞儀檢測

將細(xì)胞用PBS洗滌后，分別加入適量的熒光團標(biāo)記的抗體(CCR1-PE或者CCR7-APC)，4℃避光染色30 min，PBS洗滌2次后，并將細(xì)胞重懸于500 μl含有20 ml/L胎牛血清的PBS中，然后用FACSCantoⅡ流式細(xì)胞儀檢測。

1.6 TranswellTM遷移實驗

用24孔Transwell板(8 μm膜)檢測細(xì)胞的遷移能力。將對照組、ox-LDL組和β葡聚糖干預(yù)組的細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，收集細(xì)胞，并3組均將3×105個細(xì)胞分別種于Transwell板的上室中，添加含100 ml/L FBS DMEM培養(yǎng)基至200 μl；將CCR7的兩種配體CCL19和CCL21(濃度為200 ng/ml)加入到下室中，添加DMEM培養(yǎng)基至600 μl。以上的三組細(xì)胞分別做2個復(fù)孔，其中一個復(fù)孔，37℃、50 ml/L CO2條件下孵育4 h后用鑷子小心取出上室并吸干培養(yǎng)基，用棉簽擦掉小室上層細(xì)胞，移到預(yù)先加入約600 μl 75%乙醇的孔中，室溫固定30 min，再將小室拿出底面朝上晾干，伊紅和美藍(lán)染色后用流水輕輕沖掉多余染料，底面朝上晾干，顯微鏡觀察拍照；另外一個復(fù)孔，細(xì)胞孵育12 h后，用血球計數(shù)板計數(shù)從上室遷移到下室中的細(xì)胞，臺盼藍(lán)染色，計數(shù)活細(xì)胞數(shù)。結(jié)果用細(xì)胞遷移指數(shù)(實驗組趨化至下室的細(xì)胞數(shù)/對照組趨化至下室的細(xì)胞數(shù))來表示。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

用Graphpad Prism 6.0軟件進行統(tǒng)計分析，兩組間的均數(shù)比較采用t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 β葡聚糖抑制巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞的形成

油紅O染色檢測發(fā)現(xiàn)極少數(shù)的對照組細(xì)胞被油紅O染色，當(dāng)用ox-LDL處理巨噬細(xì)胞后，細(xì)胞被染成暗紅色，胞內(nèi)脂質(zhì)明顯增多；與ox-LDL組比較，β葡聚糖干預(yù)組中細(xì)胞吞噬了β葡聚糖后，細(xì)胞變大，胞內(nèi)脂質(zhì)聚集減少，細(xì)胞質(zhì)染色變淺，表明β葡聚糖可抑制巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞的形成，見圖1。

2.2 β葡聚糖抑制TNF-α的表達(dá)并促進CCR7的高表達(dá)

熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，ox-LDL組中TNF-α、IL-6和IL-10的mRNA表達(dá)增多；而當(dāng)同時加入β葡聚糖后，ox-LDL誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞中TNF-α的表達(dá)明顯減少(P<0.05)，IL-6和IL-10的表達(dá)無明顯差別，而TGF-β的表達(dá)幾乎沒有變化(圖2A)；此外，與ox-LDL組相比，β葡聚糖干預(yù)組細(xì)胞中趨化因子受體CCR1、CCR2、CCR5和CCR7的mRNA均有所增多，其中CCR1和CCR7的表達(dá)差異最為明顯(均為P<0.05)(圖2B)。流式細(xì)胞術(shù)進一步檢測發(fā)現(xiàn)，β葡聚糖干預(yù)組中細(xì)胞表面CCR7分子的表達(dá)水平明顯高于ox-LDL組(P<0.05)，而CCR1分子的表達(dá)變化不明顯(圖2C)。

2.3 β葡聚糖促進巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞的遷移

TranswellTM趨化實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，ox-LDL組中跨膜細(xì)胞明顯減少，細(xì)胞的遷移能力降低；同時加入β葡聚糖后，跨膜細(xì)胞的數(shù)量增多(圖3A)，且細(xì)胞遷移指數(shù)高于ox-LDL組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均為P<0.05)(圖3B)。

A：對照組；B：ox-LDL組；C：β葡聚糖+ox-LDL組圖1 β葡聚糖抑制巨噬細(xì)胞對ox-LDL的攝取(×200，油紅O染色)

A：RT-PCR檢測細(xì)胞因子的表達(dá)水平；B：RT-PCR檢測趨化因子受體的表達(dá)水平；C：流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞表面趨化因子受體CCR1和CCR7的表達(dá)。與對照組比較，aP<0.05；與ox-LDL組比較，bP<0.05圖2 β葡聚糖對巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞炎癥因子(A)及趨化因子受體(B、C)表達(dá)水平的影響

A：對照組；B：ox-LDL組；C：β-glucan+ox-LDL組圖3 β葡聚糖對巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞遷移能力的影響(×200，伊紅美藍(lán)染色)

3 討論

β葡聚糖是廣泛分布于自然界中的一種生物效應(yīng)調(diào)節(jié)劑，可作為病原體相關(guān)分子模式被巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等免疫細(xì)胞所識別，介導(dǎo)生物學(xué)功能[6]。已有研究發(fā)現(xiàn)β葡聚糖可減少巨噬細(xì)胞內(nèi)總膽固醇和膽固醇酯的聚集，抑制巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞的形成[7]。在本實驗中，我們選用的β葡聚糖是由去除原酵母菌Saccharomyces cerevisiae細(xì)胞及細(xì)胞壁剩余部分等多種處理后僅剩下“空細(xì)胞”制備而成，并采用ox-LDL誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞為泡沫細(xì)胞模型。圖1中顯示，與對照組比較，ox-LDL組中大多數(shù)細(xì)胞被油紅O染色，細(xì)胞內(nèi)含有脂質(zhì)顆粒，表明巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞制備成功；而β葡聚糖組中細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)顆粒減少，表明β葡聚糖可降低巨噬細(xì)胞對ox-LDL的攝取，抑制巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞的形成，此實驗結(jié)果與以上研究結(jié)果相一致。

研究發(fā)現(xiàn)AS斑塊中的M1型巨噬細(xì)胞可分泌大量炎癥因子，導(dǎo)致血管局部的炎癥反應(yīng)長期存在，促進斑塊惡化；而巨噬細(xì)胞吞噬ox-LDL形成泡沫細(xì)胞，也可產(chǎn)生大量的炎癥因子，炎癥又可氧化修飾LDL，為泡沫細(xì)胞形成提供有利的條件[8]。本實驗發(fā)現(xiàn)β葡聚糖下調(diào)泡沫細(xì)胞中TNF-α的表達(dá)，提示β葡聚糖通過抑制泡沫細(xì)胞的形成進而抑制其炎癥因子的分泌，延緩AS的進展。

CCR7屬于趨化因子受體超家族中的一員，可受到其配體CCL19和CCL21的趨化吸引而介導(dǎo)樹突狀細(xì)胞定向性遷移， 激活T細(xì)胞介導(dǎo)免疫反應(yīng)[9]。近年來相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)， CCR7在AS發(fā)生過程中發(fā)揮著重要的作用，如高表達(dá)CCR7的巨噬細(xì)胞可從晚期AS斑塊內(nèi)快速遷出，縮小了斑塊面積[10]；此外降低血漿中非高密度脂蛋白或增加高密度脂蛋白水平可促進單核細(xì)胞來源的細(xì)胞從斑塊內(nèi)遷移至周圍淋巴系統(tǒng)中，導(dǎo)致斑塊逆轉(zhuǎn)，其機制與CCR7介導(dǎo)巨噬細(xì)胞遷移有關(guān)[11]。我們研究發(fā)現(xiàn)，β葡聚糖處理樹突狀細(xì)胞后CCR7的mRNA表達(dá)明顯上調(diào)[12]，所以在本實驗中我們用β葡聚糖處理泡沫細(xì)胞，結(jié)果顯示CCR7的基因和蛋白表達(dá)水平都明顯增加，同時與ox-LDL處理組比較，β葡聚糖干預(yù)組的泡沫細(xì)胞表現(xiàn)出對CCL19/CCL21的趨化性也明顯上升，表明β葡聚糖可增強泡沫細(xì)胞的遷移能力。

綜上所述，β葡聚糖不但抑制巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞的形成，還可通過促進泡沫細(xì)胞趨化因子受體CCR7的高表達(dá)，增強泡沫細(xì)胞的遷移能力，這為AS的臨床治療提供新思路和實驗依據(jù)。

利益沖突：無