陶建萍 蔡永林

近年來(lái)，我國(guó)肺炎鏈球菌感染發(fā)病率逐漸升高，同時(shí)，歐美等其他國(guó)家也出現(xiàn)了較為明顯的肺炎鏈球菌感染性疾病發(fā)病率增長(zhǎng)的現(xiàn)象。β內(nèi)酰胺類抗生素是臨床治療肺炎鏈球菌感染的常用藥，而肺炎鏈球菌耐β內(nèi)酰胺類抗菌藥物現(xiàn)象的出現(xiàn)則嚴(yán)重影響了這類藥物的應(yīng)用及治療效果。因此，本研究將與兒童耐β內(nèi)酰胺類肺炎鏈球菌耐藥相關(guān)基因有關(guān)的研究綜述如下。

1 肺炎鏈球菌

作為社區(qū)獲得性肺炎、中耳炎等感染疾病的主要致病菌，肺炎鏈球菌以兒童、老年人為易感人 群[1]。這種致病菌以蛋白質(zhì)、肽聚糖及多糖等為主要成分[2]。除了社區(qū)獲得性肺炎等常見(jiàn)感染性疾病外，這種致病菌還可能誘發(fā)腦膜炎、膿胸等嚴(yán)重侵襲性肺炎鏈球菌病[3]。上述疾病的發(fā)生均會(huì)影響患者的日常生活，甚至可能威脅人們的生命安全。

2 肺炎鏈球菌耐藥

近年來(lái)，隨著抗生素濫用現(xiàn)象的加劇，肺炎鏈球菌耐藥變得越來(lái)越普遍。RR Reinert[4]認(rèn)為，肺炎鏈球菌對(duì)青霉素等β內(nèi)酰胺類抗菌藥物產(chǎn)生耐藥的作用機(jī)制主要與青霉素結(jié)合蛋白有關(guān)。機(jī)體細(xì)菌青霉素結(jié)合蛋白因相關(guān)因素影響發(fā)生突變，造成青霉素結(jié)合蛋白結(jié)構(gòu)產(chǎn)生變化，同時(shí)，上述變化導(dǎo)致這種蛋白對(duì)抗生素的親和力水平發(fā)生顯著降低，進(jìn)而誘發(fā)β內(nèi)酰胺類抗菌藥物耐藥，影響β內(nèi)酰胺類抗菌藥物的治療效果。

兒童是肺炎鏈球菌的高危感染人群。研究提示，兒童肺炎鏈球菌對(duì)亞胺培南、青霉素等的耐藥率處于上升狀態(tài)，提示肺炎鏈球菌耐藥菌株不斷增加，耐藥性不斷增強(qiáng)。2017年CHINET 中國(guó)細(xì)菌耐藥性監(jiān)測(cè)研究顯示[5]，4511 株非腦膜炎分離肺炎鏈球菌根據(jù)青霉素藥敏試驗(yàn)結(jié)果，其中3212 株兒童株中PSSP、PISP和PRSP的檢出率分別為86.8%、11.0%、2.2%。若未及時(shí)干預(yù)，β內(nèi)酰胺類抗菌藥物治療兒童肺炎鏈球菌疾病的效果將受到極大影響，進(jìn)而影響患兒的治療安全性。

3 兒童耐β內(nèi)酰胺類肺炎鏈球菌耐藥相關(guān)基因

3.1 菌株篩選菌株篩選無(wú)疑是分析兒童耐β內(nèi)酰胺類肺炎鏈球菌耐藥相關(guān)基因的關(guān)鍵。臨床肺炎鏈球菌疾病治療中常用的β內(nèi)酰胺類抗菌藥物較多，如頭孢呋辛鈉、莫西沙星、頭孢吡肟及青霉素鈉等。為了保障菌株篩選質(zhì)量，整個(gè)篩選過(guò)程除了需要嚴(yán)格參照《全國(guó)臨檢操作規(guī)程》實(shí)施操作外，還應(yīng)盡量選用E-test 法實(shí)施檢測(cè)[6]。

3.2 細(xì)菌總DNA 提取確定兒童耐β內(nèi)酰胺類肺炎鏈球菌耐藥基因是抑制肺炎鏈球菌對(duì)β內(nèi)酰胺類抗菌藥物耐藥的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。分析耐藥相關(guān)基因時(shí)，篩選出菌株后，可采用煮沸法、水浴離心處理法獲取肺炎鏈球菌耐藥基因的基因組DNA 模板[7]。

3.3 制備引物與基因檢測(cè)制備引物時(shí)，為了確保耐藥相關(guān)基因分析效率，可將GenBank 登錄肺炎鏈球菌R6 株全基因序列作為參照依據(jù)。而行基因檢測(cè)時(shí)，應(yīng)分別以隨機(jī)抽樣法選擇數(shù)量接近的β內(nèi)酰胺類抗菌藥物耐藥菌株等。Huang Yong等[8]認(rèn)為，應(yīng)將PBP2b 基因、PBP1a 二等青霉素結(jié)合蛋白基因、青霉素耐藥相關(guān)基因、肺炎鏈球菌非青霉素結(jié)合蛋白基因納入耐藥相關(guān)基因分析的范疇，而基因檢測(cè)方法則應(yīng)選用PCR 法。

3.4 PCR 擴(kuò)增及基因測(cè)序PCR 擴(kuò)增緩解中，為了確保最終耐藥相關(guān)基因分析結(jié)果的準(zhǔn)確性，應(yīng)分別設(shè)置陰性對(duì)照組（選用肺炎鏈球菌ATCC 49619DNA模板）、空白對(duì)照（無(wú)DNA 模板），由此判斷PCR 反應(yīng)的特異性。朱奇峰[9]指出：耐藥相關(guān)基因分析中，假陽(yáng)性結(jié)果、假陰性結(jié)果的產(chǎn)生可影響最終分析結(jié)果的準(zhǔn)確性，因此，PCR 擴(kuò)增試驗(yàn)應(yīng)分別針對(duì)每個(gè)樣本的PCR 反應(yīng)重復(fù)1次，以確保最終耐藥相關(guān)基因分析結(jié)果可作為肺炎鏈球菌對(duì)β內(nèi)酰胺類抗菌藥物耐藥抑制工作的參照依據(jù)。基因測(cè)序時(shí)，需將標(biāo)準(zhǔn)β內(nèi)酰胺類抗菌藥物敏感菌株作為測(cè)序結(jié)果的參照依據(jù)[10]，最終根據(jù)所分析基因的變異率信息及氨基酸置換模式，判斷其是否與肺炎鏈球菌耐β內(nèi)酰胺類抗菌藥物有關(guān)[11]。

3.5 相關(guān)基因分析結(jié)果

3.5.1 PBP 基因 事實(shí)上，面對(duì)當(dāng)前臨床日益增長(zhǎng)的肺炎鏈球菌耐β內(nèi)酰胺類抗生素問(wèn)題，探討肺炎鏈球菌耐藥機(jī)制及耐藥相關(guān)基因勢(shì)在必行。柏曉輝[12]將由青霉素結(jié)合蛋白改變誘發(fā)的肺炎鏈球菌耐β內(nèi)酰胺類抗生素作為重點(diǎn)，分析這種致病菌的耐藥相關(guān)基因，結(jié)果表明：青霉素結(jié)合蛋白基因變異發(fā)生于SSN 序列及其周?chē)鷧^(qū)域、STMK 序列，青霉素結(jié)合蛋白基因（PBPs）變異是造成肺炎鏈球菌感染患兒β內(nèi)酰胺類抗菌藥物耐藥的主要原因。韓嬌等[13]通過(guò)對(duì)肺炎鏈球菌感染患兒耐藥相關(guān)基因的分析指出：肺炎鏈球菌對(duì)β內(nèi)酰胺類抗生素耐藥與PBP2x、PBP1a、PBP2b 變異有關(guān)，且當(dāng)基因保守序列及周?chē)儺愇稽c(diǎn)數(shù)量增加時(shí)，β內(nèi)酰胺類抗生素最小抑菌濃度參數(shù)也將隨之產(chǎn)生變化，二者呈正相關(guān)。

張春玲等[14]研究中詳細(xì)探討了肺炎鏈球菌耐藥基因—PBP2b的氨基酸置換模式，在PBP 耐藥基因中，PBP2b 基因最先發(fā)生變異，氨基酸置換主要發(fā)生于T431/Q432-F437 序列中（置換氨基酸數(shù)量為6～7個(gè)）。Matsumoto Ayumi等[15]的研究也驗(yàn)證了上述觀點(diǎn)，并指出：PBP2b 耐藥基因中保守序列448SSN 可能是導(dǎo)致肺炎鏈球菌感染患兒對(duì)青霉素耐藥的主要原因。該保守序列中，氫鍵為青霉素R1 側(cè)鏈碳基與序列中450Asn的連接媒介，而在該保守序列后，氫鍵的媒介作用可受到Thr451-Ala 突變機(jī)制的干擾，同時(shí)，這一機(jī)制還會(huì)造成PBP2b 基因?qū)η嗝顾剡@種β內(nèi)酰胺類抗生素的親和力下降，進(jìn)而影響其治療肺炎鏈球菌干擾患兒的效果。俞春松等[16]的研究也闡述了類似觀點(diǎn)。

季偉等[17]指出：PBP2x 氨基酸置換為造成肺炎鏈球菌耐藥的主要原因，二者之間的關(guān)聯(lián)可通過(guò)定向誘導(dǎo)試驗(yàn)、PBP2x與肺炎鏈球菌的關(guān)系（前者為后者的必需蛋白質(zhì)之一）等進(jìn)行證實(shí)。樊歡等[18]也將PBP2x 作為肺炎鏈球菌耐藥相關(guān)基因分析的重點(diǎn)，其在研究中指出：這種基因?qū)Ψ窝祖溓蚓退幮缘挠绊懪cThr338-Ala 變異有關(guān)，原因?yàn)檫@種變異機(jī)制可波及β4 區(qū)域及α2 區(qū)域的氫鍵結(jié)合力，導(dǎo)致水分子結(jié)構(gòu)形成受到感染，進(jìn)而造成對(duì)β內(nèi)酰胺類抗菌藥物的?；饔孟陆?。

研究指出：PBP1a 在β內(nèi)酰胺類抗菌藥物（頭孢噻肟、青霉素等）的高度耐藥中扮演著重要角色[19]。石燕華等[20]以頭孢噻肟的青霉素結(jié)合蛋白轉(zhuǎn)化敏感菌株、肺炎鏈球菌高度耐藥菌株開(kāi)展實(shí)驗(yàn)分析，結(jié)果均證實(shí)PBP1a 基因與β內(nèi)酰胺類抗菌藥物耐藥存在關(guān)聯(lián)。張春玲等[21]的研究也與上述結(jié)果一致。

3.5.2 非PBP 基因 Müller Miriam等[22]在研究中重點(diǎn)探討了非PBP 基因變異與肺炎鏈球菌耐藥的關(guān)聯(lián)：murM 基因變異可造成肺炎鏈球菌對(duì)頭孢曲松、青霉素等β內(nèi)酰胺類抗菌藥物耐藥，但其僅限于接受高水平β內(nèi)酰胺類抗生素治療對(duì)象（頭孢曲松、青霉素的高水平范圍分別為抗生素最小抑菌濃度超出2μg/L、8μg/L）。丁晶晶等[23]的研究認(rèn)可了murM 基因變異與肺炎鏈球菌耐藥的關(guān)聯(lián)，但同時(shí)指出：這種基因無(wú)法單獨(dú)誘發(fā)肺炎鏈球菌耐藥，而需與其他基因形成聯(lián)合機(jī)制，方可影響β內(nèi)酰胺類抗菌藥物治療肺炎鏈球菌感染性疾病的效果。

Ma X等[24]在研究中分析了CiaH 這種非PBP基因?qū)Ψ窝祖溓蚓退幍挠绊懀哼@種基因的胞內(nèi)C端、胞外N 端分別具有良好的激酶活性及感應(yīng)器功能，同時(shí)也含有組胺激酶-受體CiaRH 系統(tǒng)。組胺激酶-受體CiaRH 系統(tǒng)可對(duì)有不同階段細(xì)胞壁抑制劑誘發(fā)的細(xì)胞溶解機(jī)制產(chǎn)生較強(qiáng)的抵抗作用，因此，可認(rèn)為CiaH 基因與肺炎鏈球菌對(duì)萬(wàn)古霉素等β內(nèi)酰胺類抗生素耐藥有關(guān)。

樊歡[25]認(rèn)為：cpoA 基因可造成兒童肺炎鏈球菌對(duì)哌拉西林耐藥。這種非PBP 基因與CiaH 基因?qū)Ψ窝祖溓蚓退帣C(jī)制影響的區(qū)別在于：后者對(duì)肺炎鏈球菌感受態(tài)的誘導(dǎo)活性消失，而cpoA 這種糖基轉(zhuǎn)移酶耐藥基因則仍保留一定的肺炎鏈球菌感受態(tài)誘導(dǎo)活性，但這一特征的出現(xiàn)階段較晚，因此可認(rèn)為這種基因參與肺炎鏈球菌耐β內(nèi)酰胺類的耐藥機(jī)制。

3.6 兒童耐β內(nèi)酰胺類肺炎鏈球菌耐藥相關(guān)基因的研究?jī)r(jià)值β內(nèi)酰胺類抗菌藥物作為臨床治療肺炎鏈球菌感染的首選藥物，其兼具經(jīng)濟(jì)成本低、療效顯著等多種優(yōu)勢(shì)[26]。但由于抗生素的普及、濫用引發(fā)的肺炎鏈球菌耐藥影響了這類抗菌藥物優(yōu)勢(shì)的發(fā)揮。而通過(guò)分離菌株、青霉素耐藥相關(guān)基因TEM 檢測(cè)等流程分析肺炎鏈球菌的耐藥相關(guān)基因，則可為這種致病菌耐藥機(jī)制提供良好的理論依據(jù)。此外，臨床檢驗(yàn)結(jié)果證實(shí)[27]，部分耐β內(nèi)酰胺類抗生素肺炎鏈球菌感染患兒為多重耐藥，因此，耐藥相關(guān)基因分析不僅可為肺炎鏈球菌感染治療用藥提供支持，還有利于保障多重耐藥感染患兒的治療效果，并為多重耐藥菌株的流行防范提供指導(dǎo)。

綜上所述，肺炎鏈球菌耐β內(nèi)酰胺類抗生素耐藥相關(guān)基因包含PBP 基因、非PBP 基因等。單一PBP 位點(diǎn)變異難以造成肺炎鏈球菌對(duì)β內(nèi)酰胺類耐藥。因此，后續(xù)肺炎鏈球菌耐藥相關(guān)基因分析應(yīng)進(jìn)一步加強(qiáng)對(duì)不同PBP 位點(diǎn)變異內(nèi)部及其與非PBP 基因之間的關(guān)聯(lián)，進(jìn)而判定肺炎鏈球菌的耐藥機(jī)制。本研究認(rèn)為，由于不同地區(qū)的醫(yī)療環(huán)境差異較大，且醫(yī)療機(jī)構(gòu)使用β內(nèi)酰胺類抗生素的習(xí)慣各異，因此，其所產(chǎn)生的肺炎鏈球菌感染治療效果也存在一定差異。為了減輕肺炎鏈球菌感染患兒的痛苦體驗(yàn)，應(yīng)根據(jù)當(dāng)?shù)胤窝祖溓蚓純旱募膊☆愋?、病情?yán)重程度等，針對(duì)性地開(kāi)展患兒青霉素結(jié)合蛋白基因突變及非PBP 基因突變狀況的檢測(cè)，最終根據(jù)檢測(cè)結(jié)果確立用藥方案，以降低肺炎鏈球菌患兒的耐藥率，遏制多重耐藥菌株的流行及發(fā)展。