王 艷 ，彭 亮 ，王 倩 ，趙海玲 ，李 平 ★

（1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院研究生院，北京 100730；2.中日友好臨床醫(yī)學(xué)研究所 免疫炎性疾病北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100029；3.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京100029）

自噬（autophagy）是一種高度保守的降解方式，利用溶酶體降解、選擇性清除自身受損、衰老或過剩的生物大分子和細(xì)胞器，釋放出游離小分子供細(xì)胞回收利用，一方面在生理狀態(tài)或病理狀態(tài)下，降解錯誤折疊或衰老的蛋白質(zhì)和受損傷的細(xì)胞器等來維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，另一方面在營養(yǎng)缺乏等條件下，降解大分子物質(zhì)，為細(xì)胞提供所必需的氨基酸和能量[1]。

在腎臟中，自噬主要發(fā)生于足細(xì)胞及近端腎小管細(xì)胞，其他細(xì)胞如系膜細(xì)胞也呈現(xiàn)微弱自噬活性[2]。足細(xì)胞呈現(xiàn)較高水平的基礎(chǔ)自噬活性，而近端腎小管基礎(chǔ)自噬活性較低，僅在應(yīng)激時呈現(xiàn)自噬活性升高。兩者自噬活性易受營養(yǎng)狀態(tài)影響，多與代謝疾病有關(guān)，是近年來糖尿病腎臟疾?。╠iabetic kidney disease，DKD）研究的熱點(diǎn)問題[3]。

1 自噬的種類

根據(jù)細(xì)胞內(nèi)底物運(yùn)送到溶酶體腔方式，哺乳動物自噬可分為 3種主要方式：巨自噬（macroautophagy）、小自噬（microautophagy）及分子伴侶介導(dǎo)自噬（chaperonemediated autophagy，CAM）。前2種進(jìn)行選擇性和非選擇性降解胞內(nèi)蛋白、細(xì)胞器，CAM則需待降解蛋白在結(jié)合分子伴侶后，轉(zhuǎn)入溶酶體降解[4]。其中，巨自噬是最常見的自噬，本文主要介紹巨自噬的發(fā)生及調(diào)控機(jī)制，下文提到的自噬為巨自噬。

2 自噬的發(fā)生過程

真核細(xì)胞巨自噬發(fā)生過程分為3個階段：（1）吞噬泡（phagophore）階段：在營養(yǎng)缺乏缺乏、體液因子缺乏、缺氧、DNA損傷、蛋白質(zhì)錯誤、線粒體損傷、病原體感染等刺激下，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的非核糖體區(qū)域、高爾基體的部分雙層膜脫落形成自噬前體，自噬前體包繞需降解蛋白質(zhì)、細(xì)胞器和部分胞質(zhì)，形成杯狀吞噬泡；（2）自噬體（autophagosome）階段：吞噬泡不斷延伸，完全包繞需降解的蛋白質(zhì)、細(xì)胞器，形成封閉自噬體；（3）自噬溶酶體（autolysosome）階段：自噬體通過微管系統(tǒng)與溶酶體融合形成單層膜的自噬溶酶體，內(nèi)膜及其內(nèi)成分降解，自噬體膜脫落循環(huán)利用[1]。

3 自噬發(fā)生的分子機(jī)制及其調(diào)控靶點(diǎn)

3.1 自噬發(fā)生的分子機(jī)制

當(dāng)細(xì)胞處于饑餓狀態(tài)時，細(xì)胞內(nèi)Unc-51樣激酶1/自噬相關(guān)基因Ⅰ（unc-51-like kinase 1/autophagy-related genes1，Ulk1/Atg1）首先結(jié)合 Atg13、FIP200（Atg17），構(gòu)成Ulk1復(fù)合物，激活Ulk1色氨酸/酪氨酸蛋白激酶，催化自噬起始。繼而，Beclin-1（Atg6）、Atg14、hVps15 與 III型磷脂酰肌醇3激酶（class III phosphatidylinositol-3 kinase，PI-3K/hVps34）結(jié)合構(gòu)成PI-3K復(fù)合物，磷酸化磷脂酰肌醇（phosphatidylinositol，PI）生成磷脂酰肌醇三磷酸（phosphatidylinositol 3-phosphate，PIP3），招募多種定位自噬前體，促進(jìn)前體成核。

自噬前體延伸形成吞噬泡與吞噬泡閉合形成自噬體，涉及Atg12、微管相關(guān)蛋白輕鏈3（microtubule associated protein light chain 3，LC3/Atg8）泛素樣蛋白及其連接過程：（1）Atg12 形成（Atg12-Atg5-Atg16）2六聚體復(fù)合物，促進(jìn)自噬前體延伸，并招募LC3-Ⅱ自噬體定位；（2）胞漿LC3裂解為胞漿水溶性LC3-Ⅰ，LC3-Ⅰ結(jié)合磷脂酰乙醇胺，形成脂溶性LC3-Ⅱ，轉(zhuǎn)位固定于自噬前體內(nèi)膜，繼續(xù)招募新生LC3-Ⅱ。由此可見，LC3-Ⅱ表達(dá)量升高、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表達(dá)量比值升高，可以反映自噬活性升高。

胞漿中需降解的蛋白經(jīng)泛素化蛋白、p62/SQSTM1蛋白標(biāo)記后，再通過p62/SQSTM1蛋白結(jié)合LC3-Ⅱ進(jìn)入自噬溶酶體并最終被降解代謝。當(dāng)細(xì)胞自噬障礙，p62/SQSTM1蛋白不能正常降解，在胞內(nèi)聚集，可以在一定程度上反映自噬活性下降[5]。但需注意，自噬流過度活化時由于自噬體和自噬溶酶體的代償性增加，也有可能導(dǎo)致p62/SQSTM1含量增加，因此不能單純通過p62/SQSTM1表達(dá)量來確定自噬功能和自噬流狀態(tài)。

3.2 自噬發(fā)生的調(diào)控靶點(diǎn)

當(dāng)機(jī)體處于糖尿病狀態(tài)時，自噬起始主要由異常糖代謝、脂代謝、氨基酸代謝調(diào)控。胞內(nèi)低濃度氨基酸可直接激活Ulk1，誘導(dǎo)自噬。而低濃度葡萄糖主要通過腺苷酸活化蛋白激酶（adenosine 5’-monophosphate-activated protein kinase，AMPK）信號通路，激活Ulk1，其自噬強(qiáng)度遠(yuǎn)高于雷帕霉素誘導(dǎo)自噬；當(dāng)葡萄糖濃度升高時，自噬可以經(jīng)負(fù)反饋調(diào)節(jié)被抑制[6]。另外，一些特殊蛋白也可調(diào)控自噬。p32蛋白結(jié)合Ulk1，增強(qiáng)其穩(wěn)定性，敲低p32會促進(jìn)Ulk1的K48位泛素化，同時抑制Ulk1的K63位泛素化，最終導(dǎo)致了Ulk1降解。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，敲低p32明顯抑制饑餓誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬以及解偶聯(lián)劑誘導(dǎo)的線粒體自噬；此時，補(bǔ)充外源Ulk1，可以恢復(fù)細(xì)胞自噬與線粒體自噬。

自噬溶酶體形成時，構(gòu)象異常的蛋白質(zhì)、受損的細(xì)胞器等在胞內(nèi)積聚，影響正常自噬流，其主要機(jī)制涉及以下3個環(huán)節(jié)：（1）自噬體形成受阻，當(dāng)PI-3K活性被3-甲基腺素（3-methyladenine，3-MA）抑制后，ATP 供能不足、自噬前體成核障礙，自噬流早期即被阻斷，LC3-Ⅱ、及其與LC3-Ⅰ比值可正常或稍降低，p62/SQSTM1含量明顯上升；（2）自噬溶酶體成熟受阻，自噬溶酶體的成熟過程涉及自噬體與溶酶體的融合，以及融合后的酸化，融合期間需骨架蛋白微管重新聚合和H+-ATP酶連續(xù)供能，長春堿、諾考達(dá)唑和巴佛洛霉素A1可抑制微管聚合、H+-ATP酶活化，期間也可因H+-ATP酶失活，導(dǎo)致自噬溶酶體酸化障礙，此時LC3-Ⅱ、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值升高，p62/SQSTM1含量快速上升；（3）自噬溶酶體降解受阻，氯喹及其衍生物羥化氯喹等弱堿性物質(zhì)可趨向進(jìn)入溶酶體，破壞溶酶體酸性環(huán)境，抑制異常蛋白、細(xì)胞器正常降解，導(dǎo)致自噬溶酶體腫脹并于細(xì)胞內(nèi)堆積，LC3-Ⅱ、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值及p62/SQSTM1含量變化趨勢同（2）[7]，反之，自噬溶酶體降解的增強(qiáng)反而可引起LC3-Ⅱ的降低。

4 DKD自噬中的營養(yǎng)物質(zhì)敏感信號通路及其調(diào)控靶點(diǎn)

4.1 雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）通路

健康狀態(tài)下，腎小球足細(xì)胞通過維持低水平mTOR基礎(chǔ)活性和高水平基礎(chǔ)自噬活性以促進(jìn)細(xì)胞更新。而在DKD早期，mTOR可適度激活，在一定程度上保護(hù)足細(xì)胞免受損傷，利于蛋白合成、足細(xì)胞的修復(fù)。DKD進(jìn)展時，mTOR的過度激活則會抑制自噬，導(dǎo)致足細(xì)胞自我更新不足、空泡化、足突融合，以及后期的足細(xì)胞數(shù)目減少和蛋白尿[7]。mTOR是DKD中足細(xì)胞的重要自噬調(diào)控因子。

細(xì)胞內(nèi)主要有2種mTOR復(fù)合物（mTOR complex，mTORC）：對雷帕霉素敏感的mTORC1、對雷帕霉素不敏感的mTORC2。真核生物中，mTORC1活性主要由PI-3KAkt-TSCl/2-mTOR信號通路調(diào)節(jié)。

mTOR通路調(diào)控機(jī)制：（1）足細(xì)胞內(nèi)營養(yǎng)缺乏時，Atg13去磷酸化，參與Ulk1復(fù)合物形成；胞內(nèi)營養(yǎng)充足時，Atg13結(jié)合3個磷酸集團(tuán)，干擾Ulk1復(fù)合物形成，直接抑制自噬起始[8]。（2）足細(xì)胞內(nèi)能量充足時，mTORC1與Ulk1復(fù)合物結(jié)合，磷酸化Ulk1殘基Ser757，抑制Ulk1激活，抑制自噬起始[9]。（3）在機(jī)制（2）中，Ulk1 的過度磷酸化，可干擾其結(jié)合AMPK，抑制AMPK誘導(dǎo)自噬。（4）足細(xì)胞自噬產(chǎn)生的亮氨酸、精氨基酸，可以作為終產(chǎn)物負(fù)反饋調(diào)節(jié)自噬；胞內(nèi)亮氨酸濃度升高，活化GTP酶，如小G蛋白——腦中Ras同源物（ras homology enriched in brain，Rheb）和絲裂原活化蛋白 4激酶（mitogen-activated protein 4 kinase 3，MAP4K3），繼而激活mTORC1，負(fù)反饋抑制自噬，而當(dāng)亮氨酸濃度下降則抑制mTORC1活性，但亮氨酸調(diào)節(jié)GTPase和MAP4K3的作用機(jī)制尚未明確。（5）協(xié)同溶酶體表達(dá)和調(diào)控基因網(wǎng)絡(luò)的主要轉(zhuǎn)錄因子TFEB（transcription factor EB），mTORC1磷酸化胞漿TFEB Ser 211，使其滯留胞內(nèi)無法向胞核轉(zhuǎn)送，核內(nèi)TFEB濃度降低，其溶酶體相關(guān)蛋白表達(dá)降低，溶酶體酸性環(huán)境維持障礙，抑制自噬溶酶體形成[10]；此外TFEB正向調(diào)控自噬相關(guān)蛋白，磷酸化TFEB后，自噬抑制。

4.2 AMPK信號通路

當(dāng)腎臟細(xì)胞內(nèi)葡萄糖不足、ATP濃度下降、ATP/AMP濃度比值下降，AMPK可經(jīng)磷酸化激活，誘導(dǎo)自噬起始。糖尿病（diabetes mellitus，DM）狀態(tài)下，AMPK 經(jīng)去磷酸化失活，提高AMPK活性，有利于自噬恢復(fù)。

AMPK通路調(diào)控機(jī)制：（1）低濃度葡萄糖可直接磷酸化足細(xì)胞內(nèi)Ulk1，誘導(dǎo)低水平自噬，但Ulk1主要激活途徑為AMPK通路，AMPK磷酸化Ulk1多個位點(diǎn)，激活Ulk1，直接誘導(dǎo)自噬[11，12]。（2）AMPK 磷酸化 Raptor脫離mTORC1復(fù)合物可間接誘導(dǎo)自噬。（3）HEK293細(xì)胞內(nèi)葡萄糖缺乏或AMP/ATP值升高時，AMPK活化并磷酸化TSC2，增強(qiáng) TSC2對 Rheb抑制，抑制 mTOR通路活化[13]。（4）AMPK 可通過（2）、（3）抑制 mTORC1 磷酸化 Ulk1 Ser757，促進(jìn)AMPK結(jié)合并磷酸化Ulk1，誘導(dǎo)自噬起始。（5）以低糖刺激原代大鼠系膜細(xì)胞，AMPK磷酸化激活JNK1（Jun NH2-terminal kinase 1），JNK 磷酸化 Bcl-2（bcell lymphoma），解離Beclin-1-Bcl-2復(fù)合物，釋放 Beclin-1促進(jìn)PI-3K復(fù)合物形成，誘導(dǎo)自噬[14]。（6）AMPK控制叉頭轉(zhuǎn)錄因子（forkhead transcription factor，F(xiàn)OXO）表達(dá)，同時促進(jìn)FOXO1、FOXO3結(jié)合相應(yīng)基因，促進(jìn) LC3、Atg12、Bnip3等自噬相關(guān)蛋白表達(dá)，需注意FOXO3與基因的結(jié)合可被Akt抑制[14]。（7）AMPK活化可使胞內(nèi)NAD+濃度升高，激活沉默信息調(diào)節(jié)因子（silent information regulator 1，Sirt1）。其中，AMPK磷酸化Raptor，是其抑制 mTORC1關(guān)鍵機(jī)制。此外，在AMPK信號通路中，調(diào)節(jié)p27蛋白穩(wěn)定性可以影響自噬進(jìn)行，p27蛋白存在時發(fā)生自噬，p27蛋白缺失時，細(xì)胞則發(fā)生凋亡。

由上可知，mTOR信號通路與AMPK信號通路對自噬的調(diào)控作用相反，當(dāng)腎臟細(xì)胞內(nèi)營養(yǎng)不足時，AMPK通路活化，抑制mTOR通路；當(dāng)營養(yǎng)條件改變時，AMPK通路活性可降低，而mTOR通路活性升高。

4.3 Sirt1信號通路

Sirt1是依賴NAD+的去乙?；福梢酝ㄟ^多種途徑調(diào)控自噬。當(dāng)能量不足、NAD+/NADH比值升高時，Sirt1被激活，釋放抗氧化物質(zhì)，修復(fù)DNA損傷，維持端粒穩(wěn)定，同時增強(qiáng)自噬功能。除此之外，Sirt1活化后亦可調(diào)控自噬發(fā)生過程去乙酰化 Atg5、Atg7、LC3、FOXO1、FOXO3，活化FOXO1、FOXO3，促進(jìn)BNIP3基因轉(zhuǎn)錄和Bnip3蛋白表達(dá)，Bnip3結(jié)合Bcl-2，釋放Beclin-1，誘導(dǎo)自噬。而在DM狀態(tài)下，足細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)Sirt1活性下降，以上機(jī)制被抑制，應(yīng)激誘導(dǎo)性自噬活性降低，細(xì)胞損傷、衰老加快。在應(yīng)用Sirt1激動劑白藜蘆醇后，自噬活性可以部分恢復(fù)，細(xì)胞損傷減輕，蛋白尿減少、腎小球基質(zhì)擴(kuò)展減輕，腎損傷延緩[15～17]。

因此，Sirt1不僅可以保護(hù)腎臟細(xì)胞并通過調(diào)控自噬改善DKD的進(jìn)程，而且對于胰島素分泌和降糖作用有著積極的影響[18]，調(diào)節(jié)Sirt1的藥物可能成為治療胰島素抵抗和治療DKD的雙重調(diào)節(jié)藥物。

4.4 張力蛋白同源磷酸酶（phosphatase and tensin homology，PTEN）通路

PTEN是一種PIP3磷酸酶，其功能與PI-3K相反，可將細(xì)胞膜上的PIP3去磷酸化轉(zhuǎn)變?yōu)镻IP2，抑制AktmTOR通路，促進(jìn)自噬。原代人腎小球系膜細(xì)胞在高糖狀態(tài)或TGF-β刺激下，microRNA-21表達(dá)上調(diào)，與PTEN mRNA的3’UTR結(jié)合增多，抑制PTEN蛋白表達(dá)的作用增強(qiáng)，從而激活A(yù)kt-mTOR通路[19，20]。在應(yīng)用熊果酸或PI-3K抑制劑LY294002后，microRNA-21表達(dá)受到抑制，自噬活性有一定程度恢復(fù)[21]。此外，microRNA-216、microRNA-217也參與調(diào)控PTEN表達(dá)[22]。

5 DKD自噬與應(yīng)激代謝

足細(xì)胞是一種不能增殖的終末分化細(xì)胞，對于外界應(yīng)激較為敏感，當(dāng)應(yīng)激超過代謝能力，足細(xì)胞自身穩(wěn)態(tài)被破壞，細(xì)胞結(jié)構(gòu)受損、足突融合，濾過膜受損，致尿蛋白出現(xiàn)。腎小球?yàn)V出蛋白流經(jīng)近端腎小管上皮細(xì)胞，可被其重吸收，上皮細(xì)胞長期攝入過量蛋白質(zhì)，應(yīng)激儲備能力較弱，亦對應(yīng)激敏感。高血糖狀態(tài)下，細(xì)胞內(nèi)常積聚活性氧（reactive oxygen species，ROS）、糖基化終末產(chǎn)物（advanced glycation end products，AGEs）等，細(xì)胞可產(chǎn)生適應(yīng)性調(diào)節(jié)，及時清理積聚物來維持穩(wěn)態(tài)。應(yīng)激時發(fā)生的代謝機(jī)制多與自噬有關(guān)，了解兩者關(guān)系，對于預(yù)防DM引起的腎損傷具有重要價(jià)值。

5.1 晚期糖基化終末產(chǎn)物

高糖狀態(tài)下，腎小球內(nèi)皮細(xì)胞、足細(xì)胞自噬處于抑制狀態(tài)，胞內(nèi)大分子蛋白質(zhì)、核酸等非酶糖基化加快，快速增加的AGEs不能經(jīng)自噬降解，在細(xì)胞內(nèi)積聚。AGEs結(jié)合并活化晚期糖基化終產(chǎn)物受體（receptor for advanced glycation endproducts，RAGE），激活 PKC，ROS 生成增多，誘發(fā)氧化應(yīng)激、異常自噬以及細(xì)胞內(nèi)環(huán)境紊亂。此外，直接以AGEs刺激原代大鼠腎小球內(nèi)皮細(xì)胞，TAGE-RAGERhoA/ROCK通路活化，細(xì)胞骨架蛋白F-actin發(fā)生異常重排，內(nèi)皮細(xì)胞濾過率增加，腎小球炎癥加重；給予丹酚酸A治療后，RAGE表達(dá)下降，濾過率與炎癥可明顯緩解，同時一定程度上恢復(fù)自噬功能。

5.2 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS）

缺氧可通過未折疊蛋白反應(yīng)（unfold protein response，UPR）引起ERS，UPR主要涉及3種成分——轉(zhuǎn)錄因子6（transcription factor-6，ATF6）、蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶（protein kinase R-like ER kinase，PERK）和肌醇依賴酶 1（inositol requiring enzyme1，IRE）。UPR激活2條通路——IRE1-JNK通路和PERK-eIF2α（翻譯起始因于2的α亞單位，eukaryotic initiation factor-2α）通路。IRE1-JNK 通路磷酸化Beclin-1，促進(jìn)吞噬泡成核。PERK-eIF2α通路活化ATF4，促進(jìn)吞噬泡延伸和自噬體形成。研究表明，在原代人腎小管上皮細(xì)胞中，環(huán)孢素通過ERS激活自噬，保護(hù)細(xì)胞免受環(huán)孢素?fù)p傷[23]。但是在足細(xì)胞中，糖尿病、高血糖可通過ERS抑制足細(xì)胞自噬，引起足細(xì)胞損傷，在應(yīng)用TUDCA（?；敲撗跄懰幔┚徑釫RS后，自噬活性恢復(fù)，足細(xì)胞損傷減輕[24]。

5.3 氧化應(yīng)激

糖尿病狀態(tài)下，AGEs增加、PKC過度活化、多元醇途徑激活導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生大量ROS，在胞內(nèi)積聚產(chǎn)生氧化應(yīng)激。當(dāng)氧化應(yīng)激損傷HEK293細(xì)胞線粒體時，PTEN介導(dǎo)的推定激酶 1（PTEN induced putative kinase 1，PINK1）結(jié)合且磷酸化Parkin，活化PERK-eIF2α通路，激活A(yù)tg4蛋白酶從而加快LC3蛋白裂解，同時抑制mTOR活性，激活自噬，清理受損線粒體[24]。但若氧化應(yīng)激過度，激活的自噬不足以清理受損線粒體，線粒體積聚不斷產(chǎn)生ROS，線粒體損傷進(jìn)入惡性循環(huán)。

5.4 缺氧

缺氧在DKD發(fā)展中扮演重要角色。缺氧時，低氧誘導(dǎo)因子-1（hypoxia-inducible factor-1，HIF-1）激活靶基因BNIP3表達(dá)，Beclin-1生成增多，加強(qiáng)競爭性結(jié)合Bcl-2，釋放Beclin-l激活自噬[25]。

6 小結(jié)與展望

綜上所述，腎臟細(xì)胞自噬的異常改變與DKD發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。在腎臟中，自噬與營養(yǎng)物質(zhì)敏感信號通路、應(yīng)激代謝密切相關(guān)，對于維持腎臟內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定至關(guān)重要。而糖尿病時，機(jī)體處于高血糖狀態(tài)，腎臟處于營養(yǎng)過剩狀態(tài)，自噬受抑制，錯誤或衰老蛋白質(zhì)、細(xì)胞器在胞內(nèi)積聚。當(dāng)機(jī)體處于饑餓狀態(tài)時，自噬可一定程度恢復(fù)，及時清理代謝胞內(nèi)積聚AGEs、毒性蛋白、受損線粒體等，維持細(xì)胞正常穩(wěn)態(tài)。另外，DKD自噬中涉及的調(diào)節(jié)機(jī)制，為干預(yù)DKD發(fā)生發(fā)展和治療DKD提供了新方向，比如人為干預(yù)營養(yǎng)狀態(tài)，限制能量，增強(qiáng)自噬，保護(hù)腎臟，預(yù)防DKD和阻斷DKD進(jìn)展，同時新藥研發(fā)應(yīng)以部分抑制mTORC1活性為目的，避免mTORC2抑制引起細(xì)胞骨架損傷、足細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞等副作用。