唐琪 柯婷 史丹暉 榮彩麗

[摘要] 目的 探討不同濃度柚皮苷對(duì)牙周韌帶干細(xì)胞增殖和分化的影響。 方法 分別在含有0.14 mg/mL（低濃度組）和1.4 mg/mL（高濃度組）柚皮苷的細(xì)胞培養(yǎng)基上對(duì)牙周韌帶干細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，并與不含柚皮苷的細(xì)胞培養(yǎng)基（空白對(duì)照組）培養(yǎng)情況進(jìn)行對(duì)比。在培養(yǎng)1 d、4 d、7 d后對(duì)牙周韌帶干細(xì)胞的增殖情況進(jìn)行測(cè)定，在培養(yǎng)7 d、14 d后對(duì)牙周韌帶干細(xì)胞的堿性磷酸酶活性及成骨相關(guān)基因[成骨特異性轉(zhuǎn)錄因子（Runx2）、骨鈣素（OCN）、堿性磷酸酶（ALP）、Ⅰ型膠原（Col Ⅰ）]的表達(dá)進(jìn)行測(cè)定。 結(jié)果 高濃度（1.4 mg/mL）的柚皮苷對(duì)牙周韌帶干細(xì)胞的增殖具有促進(jìn)作用（P<0.05），對(duì)牙周韌帶干細(xì)胞的成骨向分化也具有一定的促進(jìn)作用，能夠顯著提高成骨相關(guān)基因（Col Ⅰ、ALP、OCN、Runx2）的表達(dá)。 結(jié)論 柚皮苷在一定的濃度和時(shí)間下，能促進(jìn)牙周韌帶干細(xì)胞的增殖與成骨向分化。

[關(guān)鍵詞] 牙周韌帶干細(xì)胞;柚皮苷;骨組織工程;牙周再生醫(yī)學(xué)

[中圖分類號(hào)] R285.5? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1673-9701（2019）33-0030-05

[Abstract] Objective To investigate the effects of different concentrations of naringin on the proliferation and differentiation of periodontal ligament stem cells. Methods The periodontal ligament stem cells were respectively cultured on the cell culture medium containing 0.14 mg/mL naringin（low concentration group） and 1.4 mg/mL naringin（high concentration group）， and compared with the cell culture medium without naringin （blank control group）. The proliferation of periodontal ligament stem cells was measured after 1， 4 and 7 days of culture. The activity of alkaline phosphatase and the expression of osteogenic related genes （Runx2， OCN， ALP， Col Ⅰ） in periodontal ligament stem cells were measured after 7 and 14 days of culture. Results The high concentration （1.4 mg/mL） of naringin promoted the proliferation of periodontal ligament stem cells. It also played a role in promoting the osteogenic differentiation of periodontal ligament stem cells and significantly increased the expression of osteogenesis related genes （Col Ⅰ， ALP， OCN， RUNX2） （P<0.05）. Conclusion Naringin can promote the proliferation and osteogenic differentiation of periodontal ligament stem cells at a certain concentration and time.

[Key words] Periodontal ligament stem cells; Naringin; Bone tissue engineering; Periodontal regenerative medicine

牙周病作為患病率很高的口腔慢性感染性疾病，迄今無(wú)根治方法，主要原因是牙槽骨炎性吸收的修復(fù)和再生存在困難。牙槽骨高度的降低和牙齦退縮引發(fā)的美觀和功能上的問(wèn)題難以解決[1]。盡管開展的骨移植和引導(dǎo)牙周組織再生（Guided tissue regeneration，GTR）術(shù)已取得一定的進(jìn)展，但因其不能使牙周膜細(xì)胞數(shù)量明顯增加和生物相容性問(wèn)題，在恢復(fù)牙周組織的生理結(jié)構(gòu)和功能上還未達(dá)到所期望的目標(biāo)[2]。柚皮苷是一種二氫黃酮類化合物，提取自蕓香科植物柚等的外殼，是中藥骨碎補(bǔ)的主要作用成分[3]。改變給藥方式直接作用于靶細(xì)胞或搭載局部生物支架緩釋控制給藥時(shí)限或?yàn)楦哞制ぼ諏?duì)牙周病療效的可能途徑[4，5]。

牙周韌帶干細(xì)胞（Periodontal ligament stem cell，PDLS）即牙周膜中的未分化間充質(zhì)細(xì)胞，是一類具有異質(zhì)性和分化潛能的細(xì)胞，具備成體干細(xì)胞的特性，是牙周組織再生的重要細(xì)胞來(lái)源[6]。誘導(dǎo)PDLS定向分化可以獲得更多的目標(biāo)功能細(xì)胞，減少非目標(biāo)細(xì)胞的自發(fā)分化。而且PDLS來(lái)源有限，牙周病拔除的牙齒因缺乏健康的牙周膜和潛在的細(xì)菌感染風(fēng)險(xiǎn)而不能使用[7]，來(lái)源于健康的第三磨牙和正畸減數(shù)拔除的牙齒數(shù)量非常有限。因此采用細(xì)胞因子或細(xì)胞因子替代產(chǎn)品或細(xì)胞因子強(qiáng)化放大產(chǎn)品如中藥某些有效成份擴(kuò)增干細(xì)胞數(shù)量并誘導(dǎo)其定向分化為目標(biāo)功能細(xì)胞具有非常重要的意義[8]。本實(shí)驗(yàn)旨在通過(guò)體外細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，觀察柚皮苷對(duì)牙周韌帶干細(xì)胞增殖與成骨向分化的影響，為柚皮苷用于牙周病的治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 主要試劑和儀器

柚皮苷（阿拉丁公司，中國(guó)）、DMEM培養(yǎng)基（Gibco，美國(guó)）、胎牛血清（FBS）（Gibco，美國(guó)）、細(xì)胞凍存液（索萊寶，中國(guó)）、CCK-8試劑盒（同仁，日本）、堿性磷酸酶試劑盒（碧云天、中國(guó)）、CO2恒溫培養(yǎng)箱（賽默飛，美國(guó)）、稱量天平（美國(guó)Ohaus公司）、-20°C冰箱（賽默飛，美國(guó)）、-80°C冰箱（賽默飛，美國(guó)）、臺(tái)式離心機(jī)（德國(guó)Heraeus公司）、無(wú)菌超凈操作臺(tái)（賽默飛，美國(guó)）、恒溫水浴鍋（上海醫(yī)用恒溫設(shè)備廠）、制冰機(jī)（美國(guó)Ross Temp公司）、光學(xué)顯微鏡系統(tǒng)（日本OLYMPUS公司）、酶標(biāo)比色儀（美國(guó)Bio-Rad公司）、微流移液器（德國(guó)Eppendorf公司）、NanoDrop 2000C（賽默飛，美國(guó)）、PCR儀（美國(guó)Bio-Rad公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 人牙周韌帶干細(xì)胞的原代培養(yǎng)? 取12～24歲患者因正畸或阻生而拔除的牙體牙周均健康的新鮮牙齒，冠根單向刮取根中1/3牙周膜，將組織塊修剪為1 mm×1 mm×1 mm，Ⅰ型膠原酶37℃振蕩消化10 min，大部分細(xì)胞游離，用吸管吹打使其充分分散，加入至含有10% FBS的DMEM培養(yǎng)基中終止消化。離心機(jī)1000 r/min離心5 min，棄去上清液，重旋沉淀，均勻接種在6 cm直徑培養(yǎng)皿中，將培養(yǎng)皿置于37℃、5% CO2飽和濕度的孵箱中。細(xì)胞長(zhǎng)至孔底60%左右時(shí)，進(jìn)行胰酶消化、傳代，取3～5代細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)研究。

1.2.2 CCK-8法測(cè)定柚皮苷對(duì)人牙周韌帶干細(xì)胞增殖的影響? 取生長(zhǎng)良好的第3代牙周韌帶干細(xì)胞，以1×104個(gè)/mL的濃度接種于96孔培養(yǎng)板，每孔接種100 μL。24 h后，棄去培養(yǎng)液，依照不同柚皮苷濃度（0 mg/mL、0.14 mg/mL、1.4 mg/mL）進(jìn)行分組，分為兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組和一個(gè)對(duì)照組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。在培養(yǎng)1 d、4 d、7 d后，將DMEM培養(yǎng)基與CCK-8試劑按9：1配置成混合液，每孔加入100 μL，置于培養(yǎng)箱2 h后，以空白對(duì)照孔調(diào)零，于450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度（Optical density，OD）。

1.2.3 柚皮苷對(duì)人牙周韌帶干細(xì)胞堿性磷酸酶活性的影響? 取生長(zhǎng)良好的第3代牙周韌帶干細(xì)胞，以2×105個(gè)/mL的濃度接種于24孔培養(yǎng)板，每孔接種100 μL。24 h后，棄去培養(yǎng)液，依照不同柚皮苷濃度（0 mg/mL、0.14 mg/mL、1.4 mg/mL）進(jìn)行分組，分為兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組和一個(gè)對(duì)照組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。在培養(yǎng)7 d、14 d后，利用堿性磷酸酶試劑盒測(cè)定樣本內(nèi)細(xì)胞堿性磷酸酶活性。

1.2.4 柚皮苷對(duì)人牙周韌帶干細(xì)胞成骨相關(guān)基因的影響? 取生長(zhǎng)良好的第3代牙周韌帶干細(xì)胞，以2×105個(gè)/mL濃度接種于24孔培養(yǎng)板，每孔接種100 μL。24 h后，棄去培養(yǎng)液，依照不同柚皮苷濃度（0 mg/mL、0.14 mg/mL、1.4 mg/mL）進(jìn)行分組，分為兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組和一個(gè)對(duì)照組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。在培養(yǎng)7 d、14 d后，通過(guò)Real-Time PCR對(duì)各組人牙周韌帶干細(xì)胞的成骨特異性轉(zhuǎn)錄因子（Runx2）、骨鈣素（OCN）、堿性磷酸酶（ALP）、Ⅰ型膠原（Col Ⅰ）的基因表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。吸凈24孔培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基，PBS緩沖液清洗3次后，向孔中加入800 μL Trizol裂解液，冰上反復(fù)吹打支架，使細(xì)胞充分裂解，收集裂解液，轉(zhuǎn)至離心管中，加入200 μL三氯甲烷后充分振蕩15 s，冰上靜置3 min。4℃，12000 g離心15 min，取上清液400 μL至另一離心管中，加入400 μL異丙醇，充分混勻后冰上靜置10 min，4℃，12000 g離心10 min。充分上清液后加入1 mL無(wú)水己醇洗滌沉淀，4℃，7500 g離心5 min后棄去液體，靜置3 min，待乙醇完全揮發(fā)后加入20 μL DEPC水溶解RNA沉淀，60℃金屬浴5 min，用NanoDrop 2000C測(cè)定抽提RNA的濃度和純度。提取1 μg RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，以GAPDH為內(nèi)參，構(gòu)建PCR反應(yīng)體系[20 μL、cDNA 1 μL、引物各0.5 μL（表1）、SYBR Green Master mix 10 μL、雙蒸水8 μL]。將配好的PCR反應(yīng)溶液置于Realtime PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)條件為95℃，1 min，緊接40個(gè)PCR循環(huán)（95℃，15 s;64℃，25 s，收集熒光）。反應(yīng)完成后進(jìn)行擴(kuò)增曲線和熔解曲線分析，基因表達(dá)量以檢測(cè)基因的初始模板量表示（2-△△Ct）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS 16軟件進(jìn)行分析，行單因素方差分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P>0.05為差異不顯著。每組實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 人牙周韌帶干細(xì)胞的原代培養(yǎng)

原代培養(yǎng)的組織塊，經(jīng)過(guò)3～5 d，爬出梭形細(xì)胞，約7 d后可長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿底部。細(xì)胞呈細(xì)長(zhǎng)狀，核圓形或卵圓形。經(jīng)傳代，3～5代內(nèi)生長(zhǎng)迅速，細(xì)胞形態(tài)不發(fā)生改變。免疫組化抗細(xì)胞角蛋白染色陰性，抗波形蛋白多克隆抗體陽(yáng)性。穩(wěn)定培養(yǎng)的3～5代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

2.2 CCK-8法測(cè)定柚皮苷對(duì)人牙周韌帶干細(xì)胞增殖的影響

對(duì)比0、0.14、1.4 mg/mL濃度柚皮苷的三種培養(yǎng)基在1、4、7 d對(duì)人牙周膜干細(xì)胞增殖情況的影響。圖1顯示經(jīng)CCK-8試劑盒檢測(cè)后所得OD值。在第1天，細(xì)胞增殖情況隨柚皮苷濃度增加略有上升，但無(wú)明顯差異（P>0.05）。在第4天，0.14 mg/mL低濃度組（0.56±0.02）略高于無(wú)柚皮苷空白對(duì)照培養(yǎng)基組（0.52±0.01），但無(wú)顯著性差異（P>0.05），1.4 mg/mL高濃度組（0.62±0.01）的細(xì)胞增殖顯著高于無(wú)柚皮苷空白對(duì)照培養(yǎng)基組（P<0.05）。在第7天，0.14 mg/mL低濃度組（0.64±0.03）高于無(wú)柚皮苷空白對(duì)照培養(yǎng)基組（0.63±0.02），仍無(wú)顯著性差異（P>0.05），而1.4 mg/mL高濃度組（0.72±0.02）的細(xì)胞增殖顯著高于其他兩組（P<0.05）。

2.3 柚皮苷對(duì)人牙周韌帶干細(xì)胞堿性磷酸酶活性的影響

圖2顯示人牙周韌帶干細(xì)胞在0、0.14、1.4 mg/mL濃度柚皮苷的三種培養(yǎng)基中7、14 d細(xì)胞堿性磷酸酶活性?？梢钥吹?，隨著時(shí)間的推進(jìn)和柚皮苷濃度的升高，人牙周韌帶干細(xì)胞堿性磷酸酶活性也隨之顯著升高（P<0.05）。0、0.14、1.4 mg/mL濃度柚皮苷在7 d時(shí)的堿性磷酸酶活性分別為（61.02±3.74）、（72.33±2.05）、（90.11±1.97）;而高濃度的柚皮苷使得牙周膜干細(xì)胞堿性磷酸酶活性上升更大。

2.4 柚皮苷對(duì)人牙周韌帶干細(xì)胞成骨相關(guān)基因的影響

2.4.1 7 d時(shí)柚皮苷對(duì)人牙周韌帶干細(xì)胞成骨相關(guān)基因的影響? 圖3顯示人牙周韌帶干細(xì)胞經(jīng)不同濃度柚皮苷培養(yǎng)7 d后細(xì)胞成骨相關(guān)基因的表達(dá)。在第7天，0、0.14、1.4 mg/mL柚皮苷濃度三組間ColⅠ基因相對(duì)表達(dá)量均有顯著性差異[（1.03±0.08）、（1.25±0.04）、（1.81±0.08）]，隨著柚皮苷的濃度增加，差異逐漸增大（P<0.05）。而三組間OCN基因的表達(dá)無(wú)明顯差異。在第7天時(shí)，1.4 mg/mL高濃度組的ALP基因表達(dá)（2.11±0.06）顯著高于空白對(duì)照組（1.17±0.12）和低濃度組（1.31±0.20）（P<0.05）。三組間的Runx2基因的表達(dá)量隨著柚皮苷濃度上升而呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，然并未有顯著性差異（P>0.05）。

2.4.2 14 d時(shí)柚皮苷對(duì)人牙周韌帶干細(xì)胞成骨相關(guān)基因的影響? 圖4顯示人牙周韌帶干細(xì)胞經(jīng)不同濃度柚皮苷培養(yǎng)14 d后細(xì)胞成骨相關(guān)基因的表達(dá)。在第14天，三組間Col Ⅰ基因相對(duì)表達(dá)量均有顯著性差異，分別為（1.01±0.10）、（2.61±0.07）、（3.07±0.12）（P<0.05）。三組間OCN基因的表達(dá)隨柚皮苷濃度上升而上升，1.4 mg/mL濃度組的基因表達(dá)量（2.20±0.23）顯著高于空白對(duì)照組（1.80±0.38）和低濃度組（1.47±0.12）（P<0.05）。但0.14 mg/mL低濃度組與空白對(duì)照組間無(wú)明顯差異（P>0.05）。在第14天時(shí)，三組間的ALP基因表達(dá)量均有顯著差異，且隨柚皮苷濃度提高而提高，分別為（1.31±0.18）、（2.23±0.12）、（2.51±0.21）（P<0.05）。在第14天，1.4 mg/mL高濃度組的Runx2基因的表達(dá)量（2.20±0.16）顯著高于空白組（1.59±0.14）和低濃度組（1.71±0.07）（P<0.05）。

3 討論

牙周病是發(fā)生于牙周組織的慢性感染性疾病，其主要病理改變是牙周袋形成和牙槽骨吸收。牙周病不僅危害牙周健康、口腔健康，也影響全身健康，與全身疾病有著密切關(guān)系。結(jié)合干細(xì)胞治療及生物因子促進(jìn)的牙周細(xì)胞組織工程學(xué)為近年來(lái)研究的熱點(diǎn)，為牙周組織再生提供了新的選擇[9]。其中種子細(xì)胞的選擇具有重要的意義[10]，必須具備干細(xì)胞的特性，可以分化成為軟硬組織新生的功能細(xì)胞和合成細(xì)胞[11]?？谇粌?nèi)相關(guān)的干細(xì)胞主要來(lái)自于牙髓、牙周膜、牙囊和牙齦乳頭等牙周組織[12]。這類細(xì)胞容易獲得，具有多項(xiàng)分化潛能，并可以自體移植。牙周韌帶干細(xì)胞已在今年的研究中被證實(shí)具有多向分化潛能，能分化成為牙周組織中所需要的纖維、牙槽骨、牙骨質(zhì)等多種組織。但牙周韌帶干細(xì)胞經(jīng)過(guò)傳代后分化潛能下降，需要一些生物因子或其他昂貴的藥物提高其增殖分化活性，而這些細(xì)胞因子價(jià)格昂貴難以推廣[13]。采用確切、高效和經(jīng)濟(jì)的方法擴(kuò)增和誘導(dǎo)干細(xì)胞定向分化對(duì)推廣牙周組織工程的運(yùn)用是非常必要的。中醫(yī)中藥是我國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的寶庫(kù)。骨碎補(bǔ)是水龍骨科斛蕨的干燥根莖（Drynaria fortunei），性溫，味苦，具有療傷止痛，補(bǔ)腎強(qiáng)骨的功效。臨床上使用的補(bǔ)腎固齒丸主要組分即為骨碎補(bǔ)，但因其作用成份龐雜，口服給藥經(jīng)機(jī)體代謝吸收有限而對(duì)牙周組織再生重建的療效不佳。目前已有相關(guān)文獻(xiàn)研究證實(shí)中藥骨碎補(bǔ)提取液具有促進(jìn)成骨細(xì)胞株MC3T3-E1細(xì)胞增殖、分化和基質(zhì)礦化的作用[14]，以及對(duì)實(shí)驗(yàn)性大鼠牙槽骨吸收模型的促成骨療效，以及將柚皮苷與生物材料相結(jié)合來(lái)修復(fù)骨缺損[15，16]。但其作用機(jī)制不明。而骨碎補(bǔ)的主要有效成分為以柚皮苷為主的二氫黃酮類化合物。這為取得廉價(jià)高效的骨促進(jìn)生物因子提供了可能性。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)CCK-8法對(duì)不同濃度的柚皮苷溶液對(duì)牙周韌帶干細(xì)胞增殖的影響進(jìn)行研究。發(fā)現(xiàn)牙周韌帶干細(xì)胞的增殖對(duì)柚皮苷的濃度呈一定的正比關(guān)系。且在一周內(nèi)，高濃度（1.4 mg/mL）的柚皮苷溶液能顯著增強(qiáng)牙周韌帶干細(xì)胞的增殖。低濃度（0.14 mg/mL）的柚皮苷溶液能提高牙周韌帶干細(xì)胞的增殖，但可能由于藥物濃度過(guò)低，沒(méi)有引起顯著性的差異。

堿性磷酸酶是一種膜結(jié)合蛋白[17]，是細(xì)胞成骨向分化的一種標(biāo)志性蛋白，在成骨細(xì)胞礦化中起著重要的作用。實(shí)驗(yàn)中，不論是高濃度組還是低濃度組都表現(xiàn)出對(duì)牙周韌帶干細(xì)胞堿性磷酸酶活性的顯著促進(jìn)。說(shuō)明可能只需要較低的有效濃度，柚皮苷即可促進(jìn)牙周韌帶干細(xì)胞的成骨向分化及成骨礦化能力。

成骨相關(guān)基因表達(dá)的檢測(cè)中，我們發(fā)現(xiàn)在整個(gè)實(shí)驗(yàn)周期，不論是高濃度組還是低濃度組，都能夠顯著促進(jìn)牙周韌帶干細(xì)胞Col Ⅰ表達(dá)的提高。Col Ⅰ是牙周組織中含量最多的膠原，是骨的含量最多的一種纖維基質(zhì)，在早期成骨中有著重要的作用。OCN與Runx 2兩種基因在7 d時(shí)，三組間未有明顯差異，而在14 d時(shí)，高濃度組有明顯表達(dá)，這可能由于這兩種基因出現(xiàn)在成骨中后期，且柚皮苷引起這兩種基因高表達(dá)的有效濃度較高。ALP基因的表達(dá)情況與2.2中堿性磷酸酶的表達(dá)情況較為一致，驗(yàn)證了柚皮苷對(duì)牙周韌帶干細(xì)胞成骨向分化及礦化的促進(jìn)作用。

綜上所述，挖掘中醫(yī)中藥中的有效作用因子，將其與現(xiàn)代牙周組織工程技術(shù)相結(jié)合。能夠?yàn)榻M織工程解決方案提供高效、經(jīng)濟(jì)的新的技術(shù)方式。柚皮苷，作為一種植物來(lái)源的化合物，有望在牙周組織再生中作為成骨促進(jìn)因子進(jìn)行作用[18]。還有相關(guān)研究表明，其對(duì)于免疫調(diào)節(jié)[19，20]、抑菌抗炎[21，22]也有一定的作用。這些作用的機(jī)制還有待進(jìn)一步的探索。

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（收稿日期：2019-07-15）