莫紫梅，袁光蔚，陳寧周，鄭娟梅，王警，王海波

（廣西-東盟食品藥品安全檢驗(yàn)檢測中心，廣西南寧530021）

黃曲霉菌及其代謝產(chǎn)物黃曲霉毒素（aflatoxin，AFT）可誘發(fā)肝癌、乳腺癌等，嚴(yán)重威脅人類的健康，還會對糧食作物、水產(chǎn)、畜牧、養(yǎng)殖業(yè)等造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1]。糧食作物在生產(chǎn)、加工及流通過程中極易受黃曲霉菌及其代謝產(chǎn)物黃曲霉毒素的污染。廣西由于處于亞熱帶季風(fēng)氣候區(qū)，氣候溫暖，熱量豐富，雨水豐沛，大部分地區(qū)年降雨量為1 500 mm～2 000 mm，這種高溫高濕的環(huán)境使花生、大豆等糧食作物更易受到黃曲霉菌及其代謝產(chǎn)物黃曲霉毒素的污染。有些食用油小作坊生產(chǎn)制作的食用油，在原料采購、運(yùn)輸、保存到生產(chǎn)制作各個環(huán)節(jié)，由于缺乏相應(yīng)的技術(shù)水平或者安全意識，制作的食用油存在黃曲霉毒素污染的情況不容忽視。因此，探索一種有效降解黃曲霉毒素的方法，成為迫切需要解決的問題。

目前，黃曲霉毒素降解脫毒主要有物理法、化學(xué)法和生物技術(shù)法，本文對黃曲霉毒素的降解技術(shù)以及降解產(chǎn)物的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，并對該領(lǐng)域進(jìn)一步研究提出看法，為推動黃曲霉毒素降解應(yīng)用，尋求建立一種高效、快捷、安全處理黃曲霉毒素的新方法提供參考。

1 黃曲霉毒素的降解技術(shù)與降解產(chǎn)物解析

黃曲霉毒素的脫毒途徑是將毒素降解為無毒的小分子物質(zhì)、把毒素轉(zhuǎn)化成無毒化合物等方式。常規(guī)的脫毒方法主要有化學(xué)法、物理法、生物法和轉(zhuǎn)化解毒等[2]，其特點(diǎn)見表 1[3-5]。

1.1 物理降解技術(shù)及降解產(chǎn)物

1.1.1 輻照

輻照降解毒素的原理是利用電離輻射產(chǎn)生的高能射線使分子結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，從而改變其原有的生化特性，主要是通過發(fā)生加成反應(yīng)、消去反應(yīng)等轉(zhuǎn)變成為無毒或低毒的中間產(chǎn)物[6]，或者破壞其中的物質(zhì)結(jié)構(gòu)，實(shí)現(xiàn)毒素的降解[6]。目前主要有紫外線輻照、60Co、137Cs產(chǎn)生的γ射線、電子束等用于生物毒素的脫毒研究[7]，特別是AFT的脫毒。不同的脫毒方式，用于不同介質(zhì)中AFT的降解，會產(chǎn)生不同的降解產(chǎn)物。

表1 脫毒技術(shù)特點(diǎn)[3-5]Table 1 The characteristic of detoxification technology

微波降解AFT是由于電磁振蕩效應(yīng)誘導(dǎo)AFT發(fā)生降解，降解產(chǎn)物的毒性結(jié)構(gòu)二氫呋喃環(huán)雙鍵被破壞[8]，微波輔助堿法降解稻米中黃曲霉毒素B1（aflatoxin B1，AFB1）后降解產(chǎn)物，經(jīng)超高效液相-四級桿串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜儀（ultra-performance liquid chromatography quadruple-time-of-flight mass，UPLC Q-TOF MS） 技術(shù)發(fā)現(xiàn)有 m/z 319.081 3、341.055 9、283.061 0、301.063 4、347.076 2等降解產(chǎn)物[8]。

電子束亦被學(xué)者用于黃曲霉毒素降解的研究，不同介質(zhì)中的AFT，其降解行為、降解產(chǎn)物及路徑會有區(qū)別?；ㄉ山?jīng)過電子束照射后，其中的AFB1會發(fā)生強(qiáng)烈的輻解反應(yīng)，迅速引發(fā)了AFB1分子的氧化反應(yīng)，使其斷裂成為一些不具有紫外吸收信號的小分子物質(zhì)，而水中的AFB1經(jīng)電子束照射后，其降解產(chǎn)物則為D1（C16H12O7）、D2（C16H16O6）、D3（C17H14O8）、D4（C15H12O6）、D5（C17H12O7）等 5 種，D2、D4 分子量小于 AFB1母核分子量，可能是分子結(jié)構(gòu)發(fā)生基團(tuán)斷裂現(xiàn)象，D1、D3、D5分子量大于AFB1母核分子量，可能是分子結(jié)構(gòu)斷裂后又發(fā)生聚合反應(yīng)，其降解過程是AFB1在C（6a）-O（7）處發(fā)生分子間氫提取反應(yīng)，并在 C（1）-C（2）和 C（3）-C（3a）處發(fā)生消去反應(yīng)生成 D4，AFB1在 C（8）-C（9）處發(fā)生加成反應(yīng)生成D3，D3再發(fā)生消去反應(yīng)、還原反應(yīng)等生成D1、D2和D5，降解產(chǎn)物結(jié)構(gòu)與AFB1類似，只在部分基團(tuán)稍有不同[9]。

利用γ射線輻照AFB1研究目前主要應(yīng)用在水溶液以及甲醇水溶液中，其降解機(jī)理遵循自由基反應(yīng)機(jī)制[10]。不同介質(zhì)中的AFB1經(jīng)γ射線輻照后，由于在AFB1母核分子不同位置發(fā)生加成、重排、消去、取代等反應(yīng)，則會產(chǎn)生很多不同的輻解產(chǎn)物。如甲醇-水體系中檢測到25個輻解產(chǎn)物，其產(chǎn)物分子式主要有A1（C17H14O7）、A2（C16H10O5）、A3（C14H10O6）、A4（C18H16O8）、A5（C16H14O7）、A6（C17H14O8），水溶液的降解產(chǎn)物主要有A1（C17H14O7）、A7（C17H12O7）、A8（C16H12O7）、A9（C16H10O6）。其可能的機(jī)理是：A1的不飽合度（double bond equivalents，DBE）排序?yàn)?1，不飽合度較AFB1小1，說明AFB1的C8-C9位雙鍵可能發(fā)生了OH和H的加成反應(yīng)；A2的DBE、不飽合度與AFB1相同，則表明AFB1在輻照過程中其苯環(huán)側(cè)鏈上脫甲氧基形成的；A3的DBE、不飽合度與AFB1相同，推斷是AFB1在輻照過程中，失去甲基，且伴隨一個呋喃環(huán)被分解，呋喃環(huán)中氧經(jīng)過重排在五碳環(huán)被加成成為含氧的六碳環(huán)；A4的DBE排序?yàn)?1，不飽合度較AFB1小1，表明AFB1呋喃環(huán)左側(cè)雙鍵發(fā)生了加成反應(yīng)；A5的DBE、不飽合度均比AFB1小1，表明呋喃環(huán)左側(cè)雙鍵發(fā)生了加成反應(yīng)，有OH和H的加成，且分子結(jié)構(gòu)中缺少1個C，說明苯環(huán)側(cè)鏈的甲氧基被羥基取代[10]。

目前，紫外光照射在AFB1降解中的研究較多，而紫外光照射后產(chǎn)生的降解產(chǎn)物跟AFB1所處的介質(zhì)、紫外光強(qiáng)度、照射時間等有關(guān)。乙腈體系中AFB1紫外光降解產(chǎn)物有 A（C14H10O6）、B（C17H14O6）、D（C16H13O5）等，其機(jī)理是C（AFB1）物質(zhì)通過分子間氫提取反應(yīng)生成 B（C17H14O6），接著在 C（9c）-O（10）位發(fā)生光加成反應(yīng)，在 C（6a）-C（9a）處發(fā)生光消去反應(yīng)，生成較穩(wěn)定的A（C14H10O6）物質(zhì)，D（C16H12O5）產(chǎn)物則由 AFB1母核在 C（11）-O（15）發(fā)生光消去反應(yīng)生成[11]，見圖 1。

AFB1在水中的紫外光降解過程則是由AFB1的C（8）-C（9）位發(fā)生加成反應(yīng)生成中間產(chǎn)物P1（C17H14O7），P1在 C（1）-O（14）位發(fā)生的光還原和 C（4）-O（12）發(fā)生的光消去反應(yīng)形成P2（C16H14O6），同時P1在C（12）-O（13）位發(fā)生的光消去反應(yīng)產(chǎn)生P3（C16H12O7），見圖2。

花生油中AFB1的紫外降解產(chǎn)物，得到2種可能的降解產(chǎn)物：F1（C18H33N3O3）和 F2（C12H22N2O2），這兩種產(chǎn)物的產(chǎn)生可能是由于AFB1分子結(jié)構(gòu)中呋喃環(huán)末端雙鍵和內(nèi)酯環(huán)發(fā)生取代和裂解反應(yīng)形成的，并與花生油中的某些小分子化合物發(fā)生反應(yīng)形成的，其具體過程可能如下：由于AFB1的分子結(jié)構(gòu)中內(nèi)酯環(huán)部分是不穩(wěn)定的，在外界條件的影響下，會脫去羰基，丟失-CO，花生油經(jīng)紫外照射后，其中的含氮化合物會發(fā)生裂化反應(yīng)形成R-NH2、-NH2等小分子化合物，這些小分子化合物在AFB1結(jié)構(gòu)的活性位點(diǎn)-右側(cè)五元環(huán)和呋喃環(huán)上可以發(fā)生加成和取代反應(yīng)，一些-OH基團(tuán)被-NH2基團(tuán)取代，形成C16H14O4，再通過氫加成反應(yīng)和一系列復(fù)雜的化學(xué)變化后，形成C19H33N3O4，然后丟失一個-OCH3產(chǎn)生F1，而F2可能是F1中的五元環(huán)裂解后形成的[12-13]，見圖 3。

圖1 乙腈溶液中AFB1可能的降解途徑Fig.1 The possible degradation way of AFB1in acetonitrile solution

圖2 水中AFB1可能的降解途徑Fig.2 The possible degradation way of AFB1in water solution

1.1.2 熱處理法

熱處理對AFB1具有一定的降解作用。鄭海燕[14]研究報道20 mg/L的AFB1經(jīng)120℃處理后，熱降解效果不明顯，經(jīng)210℃處理后，降解率可達(dá)93.8%，利用UPLC-Q-TOF-MS分析出AFB1在甲醇水溶液體系中的降解產(chǎn)物有C17H14O7和C18H16O7，降解產(chǎn)物的雙鍵被加成，不飽合度降低。常敬華[15]分析了面包加工過程中還原性添加劑對脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON）毒素的影響，結(jié)果表明，面團(tuán)發(fā)酵結(jié)束后，其DON毒素含量變化不明顯，烘烤后面包皮中DON毒素含量則降低7.9%～15.1%，而面包囊腫DON毒素含量則降低7.4%～17.1%。朱濤等[16]考察了干燥方式對土鱉蟲黃曲霉毒素含量的影響，結(jié)果表明，土鱉蟲黃曲霉毒素B1（aflatoxin B1，AFB1）、黃曲霉毒素B2（aflatoxin B2，AFB2）、黃曲霉毒素G1（aflatoxin G1，AFG1）、黃曲霉毒素G2（aflatoxin G2，AFG2）含量與溫度及干燥時間有關(guān)。

圖3 花生油中AFB1可能的降解途徑Fig.3 The possible degradation way of AFB1in peanut oil

1.2 化學(xué)降解技術(shù)及降解產(chǎn)物

化學(xué)脫毒是采用酸處理、堿處理和氧化劑處理等能與生物毒素發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，破壞其化學(xué)結(jié)構(gòu)，從而降低或消除其毒性的一種方法。

堿處理是使生物毒素分子結(jié)構(gòu)中的內(nèi)酯環(huán)被打開進(jìn)而形成鹽，分子結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，導(dǎo)致毒性降低或者消失。羅小榮等[17]采用1%碳酸氫銨溶液和2%～5%氨水對蓮子進(jìn)行清洗，發(fā)現(xiàn)兩者對黃曲霉素的去除率可達(dá)90%以上，是由于碳酸氫銨水溶液呈堿性，易分解為二氧化碳、氨和水；氨與AFB1發(fā)生脫羥作用，導(dǎo)致其內(nèi)酯環(huán)發(fā)生裂解，達(dá)到脫毒目的。甲醇體系中AFB1在NaOH溶液作用下的降解產(chǎn)物可能是C12H11O2K，是由AFB1的雙呋喃環(huán)被完全破壞，氧雜萘鄰?fù)膬?nèi)酯結(jié)構(gòu)也脫掉了一個CO2基團(tuán)，如圖4。

圖4 AFB1在氫氧化鈉處理中的降解途徑Fig.4 The possible degradation way of AFB1treated by NaOH

NaHSO3處理下的降解產(chǎn)物可能是C16H13O5，是由AFB1母體第一個呋喃環(huán)斷裂失去一個羰基形成[18]，見圖5。

圖5 AFB1在亞硫酸氫鈉處理中的降解途徑Fig.5 The possible degradation way of AFB1treated by NaHSO3

化學(xué)氧化劑通過改變生物毒素的功能基團(tuán)改變其毒性，具有鈍化黃曲霉毒素的能力。氧化劑能夠破壞黃曲霉毒素，具有鈍化黃曲霉毒素的能力。常用氧化試劑有過氧化氫、臭氧、次氯酸鈉、氯氣等。鄭燕[18]研究了雙氧水濃度對甲醇介質(zhì)中AFB1的降解效果影響，結(jié)果表明，3%雙氧水在室溫下放置12 h，降解率達(dá)55%。利用高分辨質(zhì)譜研究推斷其降解產(chǎn)物為C14H9O4，可能是由AFB1母體第一個呋喃失去-C3H4O2，還有氧雜萘鄰?fù)Y(jié)構(gòu)中的六元環(huán)上的羰基和苯環(huán)上的甲氧基也遭破壞，見圖6。

陳冉[19]報道了臭氧對G族黃曲霉毒素的降解效果比B族好，且臭氧對AFG1、AFB2降解效率分別為70%和40%。臭氧降解AFG1的產(chǎn)物有C17H12O10、C18H16O11、C16H10O7、C16H10O10，其機(jī)理是臭氧破壞了黃曲霉毒素分子中的C8-C9位雙鍵，最終將其分解為有機(jī)酸、醛、酮、二氧化碳等小分子物質(zhì)，AFB1和AFG1中C8-C9位為不飽和雙鍵，AFG1和AFG2中氧雜萘鄰?fù)糠趾絮セ?，臭氧易攻擊AFB1和AFG1中的C8-C9位雙鍵使其降解。羅小虎[20]利用超高效液相色譜串聯(lián)四級桿飛行時間質(zhì)譜（UPLC Q-TOF MS）對不同臭氧體系下AFB1的降解產(chǎn)物進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析，研究發(fā)現(xiàn)臭氧和臭氧水純體系與AFB1反應(yīng)的主要降解產(chǎn)物有C16H16O6、C17H14O7、C16H14O5、C15H14O5、C17H12O6、C17H11O7、C17H23O9、C16H13O7、C16H17O6、C17H15O8、C16H15O7。根據(jù)產(chǎn)物結(jié)構(gòu)分析，表明在臭氧和臭氧水純體系中，AFB1降解產(chǎn)物的生成途徑AFB1的臭氧加成反應(yīng)歷程，臭氧分子作用為主，其反應(yīng)機(jī)制主要是親電和親核機(jī)制。研究表明，臭氧通常最先破壞有機(jī)物的雙鍵，AFB1中C8-C9雙鍵最容易被臭氧破壞，但仍保留二氫呋喃和香豆素的基本結(jié)構(gòu)。

圖6 AFB1在雙氧水處理中的降解途徑Fig.6 The possible degradation way of AFB1treated by H2O2

1.3 生物降解技術(shù)及降解產(chǎn)物

生物技術(shù)脫毒是目前的研究熱點(diǎn)之一，其機(jī)制是通過吸附作用或酶促反應(yīng)降解毒素或者修飾毒素分子而達(dá)到脫毒的目的[15]。通過篩選的生物菌株或降解酶的菌液、分泌胞外酶、發(fā)酵液等降解黃曲霉毒素的研究技術(shù)已應(yīng)用于了食品、飼料、制藥和環(huán)保等領(lǐng)域。崔玉琦[21]篩選出芽孢桿菌E-1-1-1，其在42℃，pH5.5，接種量為3%時對AFM1的降解率可達(dá)92.5%。左瑞雨[22]報道了乳酸菌、枯草芽孢桿菌和酵母菌單獨(dú)培養(yǎng)后以2∶1∶2混合，48h對AFB1的降解率可達(dá)82.72%。徐丹[23]報道黑曲霉FS10及其發(fā)酵產(chǎn)物對AFB1有較好的降解效果，這種降解酶是一種不耐熱的胞外酶，機(jī)理是酶促降解。發(fā)現(xiàn)AFB1經(jīng)降解酶作用后熒光強(qiáng)度明顯減弱，且產(chǎn)生了分子量為286的物質(zhì)。推測AFB1的降解途徑為：降解酶通過水解作用打開了AFB1的內(nèi)酯環(huán)結(jié)構(gòu)，生成具有β-酮酸結(jié)構(gòu)的中間產(chǎn)物，然后進(jìn)一步發(fā)生脫羧反應(yīng)，生成了m/z286的物質(zhì)，使得AFB1的毒性大大減弱。李文明[24]報道了施氏假單胞菌F4 降解 AFB1的研究，F(xiàn)4 懸浮液對 AFB1（5 μg/mL）培養(yǎng)72 h后的降解率達(dá)86.6%，培養(yǎng)102 h后檢測不到AFB1。利用紫外全掃描確定了AFB1降解產(chǎn)物可能的最大吸收波長為200 nm～210 nm和250 nm～260 nm之間，利用UPLC Q-TOF MS技術(shù)篩查出分子量為206.056 4（一級質(zhì)譜）的降解產(chǎn)物C11H10O6，對此產(chǎn)物的極性、二級質(zhì)譜碎片（54.984 4、70.979 0、81.032 4、110.974 2）進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析，推導(dǎo)該產(chǎn)物可能的結(jié)構(gòu)式是6-甲氧基-[4，9]苯并-2，10，11，13-四氫-[11，13-環(huán)氧乙烷]雙呋喃。

2 黃曲霉毒素降解產(chǎn)物的安全性評價

食物中黃曲霉毒素經(jīng)脫毒技術(shù)去除或降解后，其降解產(chǎn)物的安全性評價成了學(xué)者們研究的熱點(diǎn)內(nèi)容之一。食物經(jīng)各種毒素降解技術(shù)后的安全性評價可通過食物品質(zhì)、動物實(shí)驗(yàn)來評價。

2.1 食物品質(zhì)的安全性評價

花生油經(jīng)紫外光照射后，酸價、過氧化值會顯著增加[9，11-12，25]，油酸、亞麻酸、花生一烯酸有所降低[25]，對花生油其他品質(zhì)并無影響[11]，而花生油經(jīng)微波處理后，其酸值、碘值、過氧化值、維生素E和反式脂肪酸均未發(fā)生顯著變化[26]，且AFB1降解產(chǎn)物對細(xì)胞基本不產(chǎn)生毒性作用[12]。堿煉脫毒對花生油品質(zhì)影響很小，堿煉脫毒能改善花生油色澤，會導(dǎo)致花生油酸值、過氧化值升高，但不飽和脂肪酸無顯著變化[27]。

學(xué)者報道不同功率微波處理后牛乳的蛋白質(zhì)、脂肪、維生素C含量之間差異極顯著，乳糖含量差異不顯著[28]。微波處理對稻米中米蛋白的溶解性、起泡性、持油性、體外消化性顯著提高，乳化性先提高后下降，持水性呈下降趨勢：總巰基、二硫鍵含量增多，表面疏水性顯著性增強(qiáng)，自由巰基含量減少，表明微波輔助處理可能首先誘導(dǎo)部分米蛋白發(fā)生聚集形成可溶性大分子聚集體，但隨著微波處理時間的進(jìn)一步延長，米蛋白聚集體發(fā)生解聚形成小分子蛋白[8]。

電子束輻照會使花生粕中還原糖、總黃酮、棕櫚酸、亞油酸、油酸等含量會有少量增加，花生酸含量降低，粗脂肪、粗蛋白、氨基酸總量等無顯著變化[9]；對小麥淀粉和蛋白質(zhì)分子有破壞作用，導(dǎo)致面粉的耐機(jī)械攪拌性和操作性變差，面粉的品質(zhì)受到影響[29]。

經(jīng)臭氧處理玉米中AFB1后，玉米水分含量下降，脂肪酸酯明顯升高，色澤、黏度和糊化等性能均發(fā)生改變[20]，對玉米中脂肪酸成分沒有影響，但會影響玉米油中的脂肪酸組成[30]。

2.2 毒理試驗(yàn)的安全性評價

學(xué)者們應(yīng)用Ames和細(xì)胞毒理實(shí)驗(yàn)研究不同基質(zhì)中AFB1降解產(chǎn)物的致突變性和細(xì)胞毒性，結(jié)果表明，經(jīng)電子束輻照后，水體系中AFB1降解產(chǎn)物的致突變性降低50%以上，細(xì)胞活性降低18.61%，花生粕中AFB1降解產(chǎn)物已無毒性[9]；微波輻照降解花生油中AFB1后所產(chǎn)生的降解產(chǎn)物無致突變性，其毒性消失[26]；紫外輻照處理后的花生油無致突變性，HepG2細(xì)胞活性達(dá)95.54%，說明降解產(chǎn)物毒性降低[25]；AFB1污染的玉米經(jīng)臭氧處理后，對昆明鼠毒性顯著降低，AFB1降解產(chǎn)物對HepG2人肝細(xì)胞的凋亡顯著減少，血清中主要指標(biāo)谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性、總蛋白、白蛋白和球蛋白含量跟正常組對比無顯著差異，肝臟組織有輕微組織學(xué)改變[20]；微波輔助堿法降解稻米中AFB1降解產(chǎn)物毒性較AFB1有所降低[8]；臭氧、二氧化氯和微波輔助堿法都能有效降低黃曲霉毒素的致突變性，從而提高花生的食用安全性，但花生油的酸值、過氧化值會有輕微提高，仍低于國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定[31]。

對于生物技術(shù)脫毒后的安全性評價，眾學(xué)者通過動物試驗(yàn)、Ames試驗(yàn)和細(xì)胞毒理實(shí)驗(yàn)均有報道。動物實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，芬氏纖維微菌T3-5可降低盲腸大腸桿菌的數(shù)量，能改善AFB1對維鴨的生長性能的影響，緩解AFB1對肝臟的損傷作用并使腸道環(huán)境趨于正常，當(dāng)加菌劑量為1×108cfu時對雛鴨肝臟和腎臟無損傷作用[32]。經(jīng)施氏假單胞菌F4降解的AFB1產(chǎn)物的致突變性顯著降低[24]。解淀粉芽孢桿菌N-2對黃曲霉有顯著抑制效果，其安全無毒，對胃酸和膽鹽有耐受性，且能降低AFB1對動物的毒害作用[33]。

3 展望

黃曲霉毒素毒性巨大，危害嚴(yán)重，南方高溫高濕的環(huán)境使花生等糧食作物更易受到黃曲霉菌及其代謝產(chǎn)物黃曲霉毒素的污染，因此，食用油乃至食用農(nóng)產(chǎn)品的黃曲霉毒素的脫毒工作尤為重要且艱巨。傳統(tǒng)食用油精煉工藝中采用化學(xué)堿液處理法去除食用油中黃曲霉度毒素，但會對油脂色、香、味及營養(yǎng)成分造成不同程度的破壞和影響，而且易帶來二次污染。對于同樣存在被毒素污染安全隱患的其他食物，為其找尋到一種安全、有效、可行、高效的脫毒方法破在眉睫。對輻解產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)、組成及毒性進(jìn)行分析和安全性評估，建立完善的真菌毒素脫毒降解機(jī)制，將是今后一段時期內(nèi)真菌毒素輻照降解技術(shù)研究與應(yīng)用的重點(diǎn)。