王嵐，鄒新蓉，王小琴

(1.湖北中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床學(xué)院，武漢 430061；2.湖北省中醫(yī)院，湖北省中醫(yī)藥研究院)

糖尿病腎病(DN)是糖尿病最嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥之一，也是終末期腎衰竭的主要致病因素。據(jù)預(yù)測，至2030年，全球范圍內(nèi)20～79歲的人口中將有7.7%罹患糖尿病[1]，與之伴隨的，將是DN發(fā)病率的逐年上升。糖尿病腎病是多因素作用下的一種復(fù)雜疾病，其確切發(fā)病機(jī)制尚未闡明。其中，氧化應(yīng)激、血管鈣化、內(nèi)皮功能紊亂、腎臟纖維化等是加劇DN發(fā)生發(fā)展的重要病理基礎(chǔ)。Klotho作為一種抗衰老基因于1997年首次發(fā)現(xiàn)[2]，全長約50 kb，由5個外顯子和4個內(nèi)含子組成。Klotho主要在遠(yuǎn)端腎小管及腦脈絡(luò)叢表達(dá)，少量表達(dá)于甲狀旁腺、前列腺、胎盤等組織。迄今為止，發(fā)現(xiàn)Klotho家族包含α-Klotho，β-Klotho及γ-klotho三種蛋白。Klotho基因編碼的蛋白具有抗炎性反應(yīng)、抗氧化應(yīng)激、抗細(xì)胞凋亡、抗纖維化、抗腫瘤等多種生物學(xué)效應(yīng)。近年來相繼有研究報道，Klotho在多種急、慢性腎臟疾病如急性腎損傷、缺血性腎病、高血壓腎損害、多囊腎、腎小球腎炎、糖尿病腎病中發(fā)揮腎臟保護(hù)作用[3-7]，其中，Klotho 與糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，業(yè)已成為研究的熱點，現(xiàn)綜述如下。

1 Klotho蛋白與糖尿病腎病氧化應(yīng)激

氧化應(yīng)激是孕育糖尿病微血管并發(fā)癥的共同土壤，亦是激活DN相關(guān)信號通路的關(guān)鍵介質(zhì)之一。在高糖刺激下，增強(qiáng)的氧化應(yīng)激不僅能誘導(dǎo)足細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡，還能直接發(fā)起攻擊，導(dǎo)致細(xì)胞損傷[8-9]。同時，氧化應(yīng)激是活性氧(ROS)與抗氧化劑之間平衡被打破時的表現(xiàn)，而糖尿病是一類以ROS生成過多為特征的疾病，并由此導(dǎo)致三磷酸腺苷(ATP)高表達(dá)及腺呤能受體P2X7的激活，從而引發(fā)細(xì)胞死亡[10]。Menzies等[11]研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病患者相較于對照組，腎組織標(biāo)本中的P2X7表達(dá)增多；并通過動物實驗證明P2X7抑制劑能夠減輕DN小鼠的腎臟損害。可見，在高血糖刺激下，腎臟P2X7的激活參與了DN進(jìn)程。而近來有研究表明，在糖尿病大鼠模型中，腎臟Klotho的表達(dá)于P2X7呈負(fù)相關(guān)，且隨著病情的加劇，腎功能及氧化還原平衡參數(shù)出現(xiàn)改變時，仍維持負(fù)相關(guān)。因此，Klotho與P2X7在DN進(jìn)程中存在拮抗作用錳超氧化物歧化酶(MnSOD)可以清除體內(nèi)有害的氧自由基，具有抗氧化的作用。有研究報道：叉頭轉(zhuǎn)錄因子O3a(FoxO3a)具有提高M(jìn)nSOD表達(dá)的生物學(xué)效應(yīng)[12]，因此FoxO3a可對線粒體ROS的生成起到負(fù)調(diào)控的作用，從而拮抗氧化應(yīng)激[13]。Lim等[14]研究表明，Klotho能夠抑制FoxO3a的磷酸化，使得FoxO3a與MnSOD啟動子區(qū)域結(jié)合增強(qiáng)，揭示Klotho可能通過FoxO3a介導(dǎo)的MnSOD抑制ROS相關(guān)的氧化應(yīng)激。Liu等[15]在體外實驗中觀察到AGEs可呈劑量依賴性的增強(qiáng)氧化應(yīng)激并降低近端小管上皮細(xì)胞Klotho的表達(dá)；成功質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后，Klotho的過表達(dá)可顯著改善AGEs誘導(dǎo)的小管損傷標(biāo)志物的產(chǎn)生及細(xì)胞凋亡。提示Klotho可能通過抗氧化應(yīng)激發(fā)揮小管間質(zhì)的保護(hù)作用。

由此可見，Klotho可通過阻斷P2X7，調(diào)節(jié)FoxO3a、AGEs因子等多種途徑抗氧化應(yīng)激，發(fā)揮腎臟保護(hù)作用。

2 Klotho蛋白與糖尿病腎病血管鈣化

血管鈣化是高血壓、糖尿病、慢性腎臟病、動脈粥樣硬化等多種疾病普遍存在的病理特點。既與鈣磷代謝紊亂，鈣鹽沉積于動脈壁有關(guān)；又與骨的礦化作用類似，是一種細(xì)胞介導(dǎo)的可調(diào)控的過程，其中以血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)向成骨樣細(xì)胞表型轉(zhuǎn)變最為常見。而DN在雙重危險因素作用下，血管鈣化愈發(fā)明顯，導(dǎo)致患者致殘率及死亡風(fēng)險升高。Klotho基因敲除小鼠在4周齡時即可出現(xiàn)動脈硬化，并持續(xù)加重，表現(xiàn)動脈廣泛鈣化，而予以外源性Klotho干預(yù)后，血管病變得以明顯改善[2]。Hum等[16]發(fā)現(xiàn)，通過腺相關(guān)病毒介導(dǎo)的Klotho基因轉(zhuǎn)導(dǎo)能夠降低DN小鼠的血磷水平。Jono等[17]報道，Klotho的高表達(dá)能夠有效抑制高磷誘導(dǎo)下的VSMC向成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)分化。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在尿毒癥環(huán)境下，VSMC上的Ⅲ型鈉磷協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)體中的亞型Pit-1活性增強(qiáng)，表達(dá)升高，Pit-1可促進(jìn)磷的吸收，從而引發(fā)血管鈣化。而當(dāng)Klotho過表達(dá)時，Pit-1水平下降，成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子2表達(dá)減少；提示Klotho可能通過抑制VSMC對磷的吸收，防止VSMC向成骨細(xì)胞表型轉(zhuǎn)變，從而減輕血管鈣化[18]。成纖維細(xì)胞生長因子-23(FGF-23)是體內(nèi)重要的調(diào)磷因子，Klotho作為FGF23與FGFR結(jié)合所必須的輔助因子，協(xié)同F(xiàn)GF23調(diào)節(jié)鈣磷代謝。在DN患者的血漿及腎臟中，Klotho表達(dá)下降，隨著病情加劇，腎臟分泌的Klotho顯著減少，由此引發(fā)機(jī)體對FGF23的抵抗?fàn)顟B(tài)，導(dǎo)致血磷升高，繼發(fā)性甲狀旁腺功能亢進(jìn)，維生素D缺乏等一系列代謝紊亂的局面，最終將導(dǎo)致血管鈣化[19-23]。

以上證據(jù)表明，Klotho可能通過參與調(diào)節(jié)鈣磷代謝，抑制VSMC向成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)分化得以防治DN血管鈣化。

3 Klotho與糖尿病腎病內(nèi)皮功能紊亂

血管內(nèi)皮功能紊亂與DN 的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。廣泛的內(nèi)皮損傷是糖尿病微血管并發(fā)癥的重要危險因素之一。生理狀態(tài)下，血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)能夠調(diào)節(jié)血管通透性，促進(jìn)血管新生并維持血管功能。Klotho基因缺陷小鼠表現(xiàn)出VEGF介導(dǎo)的血管生成受損及血管通透性升高[24]。近來有報道稱Klotho蛋白可通過直接與VEGF受體2(VEGFR-2)及瞬時受體電位通道1(TPRC-1)相結(jié)合，增強(qiáng)VEGFR-2與TRPC-1之間的相互作用，從而調(diào)節(jié)VEGFR/TRPC-1介導(dǎo)的Ca2+內(nèi)流，發(fā)揮維持血管內(nèi)皮生物穩(wěn)態(tài)的作用[24]。相反，Klotho缺乏將引發(fā)Ca2+內(nèi)流持續(xù)增強(qiáng)和Ca2+依賴型蛋白酶的過度活化，促使血管損傷，血管通透性升高。可見，Klotho可能通過調(diào)節(jié)VEGF的表達(dá)參與血管病變的病理過程[25]?？烧{(diào)節(jié)腎小球血管壁通透性，發(fā)揮血管保護(hù)作用[26-27]。Kadoya等[28]報道，在早期糖尿病腎病Akita小鼠模型中可觀察到內(nèi)皮細(xì)胞糖萼缺失、腎小球巨噬細(xì)胞浸潤、腎小球肥大、系膜擴(kuò)張等病理特征，而在Klotho轉(zhuǎn)基因-Akita小鼠模型中，Klotho的過表達(dá)使以上病理損傷得以緩解。鈣蛋白酶的激活與腎小球巨噬細(xì)胞浸潤關(guān)系密切。有研究表明，抑制鈣蛋白酶的活性可以減少高糖環(huán)境下的內(nèi)皮細(xì)胞表面促炎癥黏附分子的表達(dá)[29]。而Kadoya等在細(xì)胞培養(yǎng)時，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，Klotho能夠抑制高糖誘導(dǎo)下的鈣蛋白酶激活。Manya等[30]在Klotho基因缺陷的小鼠腎臟中觀察到μ-鈣蛋白酶的激活，說明Klotho蛋白可以抑制μ-鈣蛋白酶的活化。

因此，Klotho可能是一種血管保護(hù)蛋白，通過調(diào)節(jié)VEGF的表達(dá)，維持內(nèi)皮的的生理結(jié)構(gòu)，降低內(nèi)皮細(xì)胞的炎性反應(yīng)和拮抗鈣蛋白酶的活性等途徑，改善內(nèi)皮功能，發(fā)揮DN的保護(hù)作用。

4 Klotho蛋白與糖尿病腎病腎臟纖維化

轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)信號通路的激活可引發(fā)DN腎臟纖維化[31]。有研究報道[32]，在Klotho基因缺陷小鼠腎臟中，TGFβ1的下游因子Smad2磷酸化水平增強(qiáng)，說明Klotho基因缺陷可能通過激活TGFβ1/Smad2信號通路，加劇早期DN。提示Klotho蛋白可通過拮抗TGFβ1，發(fā)揮在DN中的抗纖維化作用。目前認(rèn)為，在DN狀態(tài)下，Wnt/β-catenin信號通路的激活參與了足細(xì)胞功能失調(diào)，系膜細(xì)胞凋亡，小管上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)分化的進(jìn)程，從而與DN纖維化密切相關(guān)[33]。Zhou等[34]研究表明，無論在Akita、db/db小鼠還是鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)的糖尿病小鼠腎組織中，均可出現(xiàn)Wnt、β-catenin蛋白表達(dá)上調(diào)。進(jìn)一步在Akita糖尿病小鼠模型中觀察到，Wnt信號通路的激活可導(dǎo)致多種促纖維化因子的過度生成，而予以Wnt信號通路阻斷劑干預(yù)后，Akita糖尿病小鼠腎臟的纖維化、炎癥狀態(tài)得以顯著改善。有學(xué)者在單側(cè)輸尿管梗阻及阿霉素誘導(dǎo)的腎臟纖維化小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，β-catenin的活化與Klotho蛋白表達(dá)減少關(guān)系密切，且在體外實驗中發(fā)現(xiàn)，Klotho能夠與Wnt1、Wnt4和 Wnt7a等多種配體相結(jié)合，從而抑制Wnt信號通路的激活。證明了Klotho是Wnt/β-catenin信號通路的內(nèi)源性阻斷劑[35]。而在本課題組的前期研究中，同樣證明了Klotho與Wnt/β-catenin的負(fù)向調(diào)控關(guān)系。在STZ誘導(dǎo)的DN小鼠腎組織中Klotho蛋白表達(dá)較健康對照組明顯下降，Wnt、β-catenin蛋白表達(dá)顯著上調(diào)；而中藥治療組DN小鼠中，Klotho蛋白表達(dá)較模型組明顯增加，而Wnt、β-catenin蛋白表達(dá)水平則相反[36]。亦有學(xué)者在單側(cè)腎切除的糖尿病小鼠中發(fā)現(xiàn)，經(jīng)重組Klotho干預(yù)后，腎小球肥大及促纖維化指標(biāo)均明顯下調(diào)[37]。

以上種種證據(jù)表明，Klotho通過參與調(diào)控TGF-β1、Wnt信號通路等多種途徑拮抗DN纖維化的進(jìn)程，發(fā)揮腎臟的保護(hù)作用。

5 小結(jié)

現(xiàn)階段臨床上針對糖尿病腎病所導(dǎo)致的高致殘率、高死亡率，尚無確切有效的治療方案，尋找新的治療靶點，將具有重要意義。Klotho作為一種抗衰老蛋白，可通過抗氧化應(yīng)激、抑制血管鈣化、調(diào)節(jié)內(nèi)皮功能、拮抗腎臟纖維化等多種途徑保護(hù)腎臟，有望成為糖尿病腎病新的治療靶點。