岳文莉， 田同德， 田同良， 楊 督

鄭州大學附屬腫瘤醫(yī)院中西醫(yī)結合科，河南 鄭州 450008

胃癌是最常見的消化道腫瘤，死亡率居于所有惡性腫瘤的第2位，我國是胃癌高發(fā)國家，發(fā)病和死亡例數(shù)遠高于其他國家，是我國癌癥防治的重點[1]。盡管過去幾十年中治療手段不斷豐富，但對于胃癌的復發(fā)和轉移仍無很好的解決辦法，治療預后較差。腫瘤細胞通常處于一個復雜的微環(huán)境中，腫瘤微環(huán)境由免疫細胞、基質細胞、內皮細胞以及多種細胞因子和趨化因子等組成，在腫瘤組織微環(huán)境中有許多巨噬細胞的浸潤，這些細胞被稱為腫瘤相關巨噬細胞(tumor associated macrophages，TAMs)[2]。TAMs參與腫瘤的侵襲和遷移，在腫瘤微環(huán)境中存在兩種不同的分化類型，分別是經典活化的巨噬細胞M1型(classically activated macrophage，caMphi)和替代性活化的巨噬細胞M2型(alternatively activated maemphage，aaMphi)。M1型巨噬細胞活化需要干擾素-γ(IFN-γ)和細菌及其產物脂多糖(LPS)等細胞因子相互作用進一步表現(xiàn)出較高的抗原提呈能力?？煞置诙喾N炎癥因子，如IL-1、IL-6、IL-12、腫瘤壞死因子(TNF)和趨化因子CCL2、CCL5、CCL22等，對細菌病原體和腫瘤細胞有殺傷作用。M2型巨噬細胞的活化不像M1型巨噬細胞需要多種細胞因子相互作用，但需要有合適的誘導劑，如IL-4、IL-10、轉化生長因子-β(TGF-β)等?？筛叻置贗L-1受體拮抗劑和趨化因子CCL17、CCL22及巨噬細胞替代激活相關化學因子(AMAC-1)等，具有抑制免疫應答和促進傷口愈合的能力[3]。巨噬細胞極化的信號通路特別復雜，在已有的研究中TAMs表型對腫瘤細胞影響具有雙重性。本研究希望通過建立胃癌MGC-803細胞與M1、M2型巨噬細胞共培養(yǎng)體系，模擬胃癌細胞侵襲、遷移的體外實驗，更加深入地了解胃癌細胞在巨噬細胞影響下自我復制、分化的能力，擬于通過研究了解不同細胞因子對胃癌的作用，改變腫瘤的免疫微環(huán)境以找到新的治療胃癌的方法。

1 材料與方法

1.1材料與試劑人胃癌細胞MGC-803人單核樣淋巴瘤細胞U937均購自中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所基礎醫(yī)學細胞中心。DMEM高糖培養(yǎng)基、RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清、質量濃度為25 g/L的胰酶細胞消化液購自以色列BI公司，PBS磷酸鹽緩沖液粉末、DAPI溶液(1 g/L)、細菌LPS、人IL-4、BCA蛋白濃度測定試劑盒、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒購自北京Solarbio公司，佛波酯(PMA)購自美國Sigma公司，人IL-10、IL-12 P70 ELISA試劑盒購自江蘇ExCell Bio公司，6孔板、6 cm細胞培養(yǎng)皿、10 cm細胞培養(yǎng)皿購自無錫NEST公司，15 ml離心管、50 ml離心管、1.5 ml EP管、0.5 ml EP管、槍頭購自美國Biologix公司，Transwell 24孔板購自美國Corning公司，TNF-α、IFN-γ、TGF-β、NF-κB P65抗體購自美國Abcam公司，PVDF膜購自美國MILLIPORE公司，超敏ECL化學發(fā)光試劑盒購自江蘇碧云天公司。GE Healthcare ImageQuant LAS 4000mini凝膠成像儀購自美國，Thermo Fisher SCENTIFIC Multiskan-1510型全波長酶標儀購自美國。

1.2實驗方法

1.2.1 U937細胞培養(yǎng)誘導分化：U937細胞于RPMI 1640完全培養(yǎng)基中(含質量濃度為100 g/L的FBS)，置于37 ℃、體積分數(shù)為5%的CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2～3 d傳代。取對數(shù)生長期U937細胞，經預實驗結果選取PMA 40 ng/ml誘導單核細胞分化，且連續(xù)培養(yǎng)72 h分化效果最佳，用10 cm細胞培養(yǎng)皿加入1×106ml-1細胞懸液6 ml/皿培養(yǎng)。觀察細胞貼壁情況，>80%細胞貼壁即可開始實驗，此時細胞為未極化的巨噬細胞Mφ。PBS洗滌3遍，去除不貼壁細胞及死亡細胞，且經預實驗可以得出，M1及M2細胞分別經25 μg/ml LPS及15 ng/ml IL-4誘導48 h的誘導效果最佳，取3個離心管中，分別加入6 ml RPMI 1640完全培養(yǎng)基，并依次加入0.24 μl PMA貯存液、15 μl LPS貯存液和18 μl IL-4貯存液，充分混勻，配制成40 ng/ml的PMA工作液、25 μg/ml的LPS工作液和15 ng/ml的IL-4工作液，分別加入誘導后未分化的巨噬細胞Mφ中，置于37 ℃、體積分數(shù)為5%的CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h的誘導效果最佳。

1.2.2 通過ELISA鑒定U937細胞表型：從培養(yǎng)箱中取出3種細胞的培養(yǎng)皿，分別收集3種細胞上清液至3個新的1.5 ml EP管中，在試劑盒配備的板條中以100 μl/孔，分別加入稀釋好的標準品及樣本，同時留取空白孔，每孔準備2個副孔。除空白孔外，50 μl/孔加入生物素化抗體，室溫孵育120 min。甩板，每孔加入200 μl的洗滌液，靜置30 s后甩板，重復洗滌5次。除空白孔外，每孔加入100 μl的酶結合物工作液，之后室溫孵育60 min。重復洗滌5次，包括空白孔，每孔加入100 μl顯色劑，室溫避光孵育15 min。包括空白孔，每孔加入100 μl/終止液，混勻后用全波長酶標儀測量OD450的值；導出Excel表格，計算各濃度平均值，繪制濃度-OD450值的曲線，計算樣本含量。

1.2.3 Western blotting檢測：提取細胞總蛋白，BCA法測定蛋白質濃度。制備SDS聚丙烯酰胺凝膠，按4∶1比例加入5倍蛋白上樣緩沖液后，100 ℃煮沸5 min，上樣，電壓設定為60 V，恒壓電泳，質量濃度為150 g/L的分離膠，待溴酚藍即將跑出凝膠范圍即可停止，制備“三明治”，順序依次為負極、3層濾紙、SDS凝膠、PVDF膜、3層濾紙、正極，整個操作過程完全浸泡在1×Trans工作液中進行，務必排盡氣泡，將制備好的“三明治”放入轉移槽中，按正負極連接電泳儀，200 mA恒流轉膜1.5 h，麗春紅染色，在TBST工作液中漂洗2～3遍后移入封閉液中，置于搖床上，15 r/min室溫搖蕩1 h封閉，根據(jù)蛋白分子量加入對應的一抗抗體4 ℃，10 r/min搖蕩12 h，TBST洗膜后加入二抗，15 r/min室溫搖蕩2 h，經TBST洗膜后加入超敏ECL發(fā)光液，應用化學發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)分析目的蛋白的表達。

1.2.4 胃癌MGC-803細胞的培養(yǎng)：從-80 ℃冰箱或液氮罐中取出1支凍存的人胃癌MGC-803細胞，37 ℃水浴3～5 min，待充分融化后通過傳遞倉拿入細胞間，反復洗滌3～4遍，將凍存液洗掉，取10 cm細胞培養(yǎng)皿，加入7 ml DMEM完全培養(yǎng)基，皿蓋上標明細胞種類、培養(yǎng)基種類、培養(yǎng)人姓名及日期，洗滌后的細胞內加入1 ml DMEM完全培養(yǎng)基，充分吹打混勻，加至培養(yǎng)皿內，放培養(yǎng)箱培養(yǎng)，傳代3次后，待細胞成對數(shù)期生長時可使用細胞進行實驗。

1.2.5 胃癌MGC-803劃痕實驗：將對數(shù)生長期MGC-803細胞接種于預先底部標記的6孔板內，待細胞貼壁生長100%，用20 μl無菌槍頭于底部劃痕，PBS漂洗去除脫落壞死細胞，再用無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)，繼續(xù)培養(yǎng)。劃痕后0、24、48、72、96 h選擇劃痕區(qū)固定3個視野拍照，比較各時間段劃痕愈合的情況，計算MGC-803細胞的劃痕愈合率，劃痕愈合率(%)=(0 h劃痕平均寬度-每24 h后劃痕平均寬度)/0 h劃痕平均寬度×100%，通過劃痕愈合率觀察MGC-803的遷移能力。

1.2.6 Transwell實驗：侵襲實驗選用孔徑為8 μm的Transwell小室為上室，以1∶4的比例稀釋Matrigel基質膠，吸取稀釋好的基質膠70 μl到小室上室中，待膠凝固后，上室加2×105ml-1無血清培養(yǎng)基的Mφ、M1、M2細胞混懸液250 μl，下室加入完全培養(yǎng)基MGC-803細胞混懸液750 μl，37 ℃細胞培養(yǎng)箱中孵育24 h，取出小室用質量濃度為100 g/L的TCA(三氯乙酸)4 ℃、1 h固定細胞，PBS清洗3遍，用質量濃度為5 g/L 結晶紫常溫孵育2 h，用PBS洗2遍盡量洗凈小室內結晶紫，用棉棒輕輕擦拭小室里面無侵襲的細胞，隨機選取10個視野，顯微鏡200倍下計數(shù)侵襲至上室外的細胞并拍照。

1.3統(tǒng)計學方法所有實驗重復3次以上，采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，計數(shù)資料對比采用卡方檢驗；計量資料，對多組數(shù)據(jù)間比較符合正態(tài)分布進行單因素方差分析，不符合正態(tài)分布進行非參數(shù)檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1人巨噬細胞的誘導分化及表現(xiàn)鑒定未經PMA誘導的人單核細胞淋巴瘤細胞U937成懸浮生長的圓球形(見圖1)，經PMA誘導48 h后大部分細胞由懸浮逐漸形成貼壁狀態(tài)伸出偽足，呈長梭形，具備巨噬細胞形態(tài)，為TAMs誘導分化成功狀態(tài)(見圖2)。U937細胞誘導的M1型巨噬細胞較同細胞來源的Mφ細胞分泌的IL-10偏低、IL-12p70偏高，且IL-10的差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。U937細胞誘導的M2型巨噬細胞較同細胞來源的Mφ細胞分泌的IL-10偏高、IL-12p70偏低，且IL-10的差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。U937來源的M1、M2型巨噬細胞分泌的IL-10和IL-12p70間的差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(見

表1、圖3～4)。誘導后腫瘤相關巨噬細胞M1型可分泌IL-6、TNF-α等促炎因子，對腫瘤細胞起抑制作用，在Western blotting中與β-actin相比為高表達，在NF-κB P65、HIF-1α等抗炎因子中為低表達，M2型腫瘤相關巨噬細胞可分泌NF-κB p65、HIF-1α等抗炎因子，對腫瘤細胞起促進作用，在Western blotting中與β-actin相比為高表達，在IL-6、TNF-α等促炎因子中為低表達，Mφ巨噬細胞介于M1、M2型巨噬細胞之間，更傾向于M2型巨噬細胞，對MGC-803細胞的增殖有一定的促進作用(見圖5～6)。

圖1未經PMA誘導的人單核細胞淋巴瘤U937；圖2經PMA誘導48h后未分化的巨噬細胞Mφ

Fig1HumanmononuclearlymphomacellU937notinducedbyPMA;Fig2Undiffe-rentiatedmacrophageMφafter48h

induced by PMA

注：與同細胞來源Mφ相比，*P<0.05；▲P<0.01；與同細胞來源M1相比，■P<0.05；●P<0.01。

圖3 U937細胞來源不同表型細胞分泌IL-12p70；圖4 U937細胞來源不同表型細胞分泌IL-10Fig 3 Different phenotypic cells secreted IL-12p70 from U937 cells;Fig 4 Different phenotypic cells secreted IL-10 from U937 cells

2.2MGC-803的侵襲、遷移作用待細胞在培養(yǎng)皿內覆蓋率達95%時開始劃痕實驗，通過劃痕實驗計算出細胞愈合率，劃痕后0、24、48、72、96 h，胃癌MGC-803愈合率逐漸增加，24、48、72、96 h愈合率分別為8%、32%、49%、59%。通過細胞愈合率可以觀察到MGC-803具有自主遷移能力，具有驗證腫瘤相關巨噬細胞侵襲和遷移能力，與預期實驗結果一致，可繼續(xù)進行后續(xù)實驗(見圖7～8)。

2.3TAMs對MGC-803細胞的侵襲、遷移能力的影響Transwell實驗結果提示：對比純培養(yǎng)基，U937來源的Mφ對MGC-803細胞的遷移無明顯影響，M1型巨噬細胞對MGC-803細胞的遷移有抑制作用(P<0.01)，M2型巨噬細胞對MGC-803細胞的遷移有促進作用(P<0.05)(見圖9)。對比純培養(yǎng)基，U937來源的Mφ對MGC-803細胞的侵襲無明顯影響，M1型巨噬細胞對MGC-803細胞的侵襲有抑制作用(P<0.01)，M2型巨噬細胞對MGC-803細胞的侵襲有促進作用(P<0.05)(見圖10)。

圖5～6 U937細胞誘導后來源不同表型細胞在Western blotting上表達IL-6、TNF-α、HIF-1α、NF-κB p65Fig 5-6 U937 cells expressed IL-6, TNF-α, HIF-1α, NF-κB p65 on Western blotting from different phenotypic cells

圖7 劃痕實驗后在顯微鏡下細胞自主遷移能力(100×)Fig 7 The ability of cells to migrate autonomously under microscope determined by scratch test (100×)

圖8 劃痕實驗細胞愈合率Fig 8 Cell healing rate by scratch test

3 討論

胃癌在中國惡性腫瘤的發(fā)病率和死亡率一直居高不下，胃癌細胞的高侵襲性是導致胃癌患者死亡的主要原因，因此，研究胃癌細胞侵襲作用的分子機制并探索有效的免疫治療成為目前胃癌研究的主要方向[4]。近年來，腫瘤免疫治療的飛速發(fā)展使現(xiàn)代醫(yī)學對腫瘤生物和免疫學有了更好的了解。而腫瘤微環(huán)境作為腫瘤細胞免疫逃逸和免疫抵抗的主要場所，存在諸多復雜因素參與腫瘤細胞和免疫系統(tǒng)的相互作用，相同的細胞因子在不同的腫瘤微環(huán)境中可以發(fā)揮兩種截然不同的作用，具有一定的雙重性，因此通過改變腫瘤的免疫微環(huán)境讓相應的免疫細胞因子發(fā)揮抗腫瘤的作用是目前的研究方向[5]。本研究中，成功通過體外實驗將人單核樣淋巴瘤U937細胞誘導成未分化的巨噬細胞；并運用不同細胞因子誘導不同表型的TAMs。不同表型的巨噬細胞通過ELISA檢測顯示出截然不同的兩種極端。這說明機體在腫瘤微環(huán)境中存在不同類型的巨噬細胞，且這些不同類型的巨噬細胞發(fā)揮著不同的功能，對腫瘤細胞的侵襲和遷移起著不同的調節(jié)作用。此外，PMA誘導的Mφ巨噬細胞的細胞因子分泌水平與M2型巨噬細胞更為接近，提示未激活的巨噬細胞對腫瘤所產生的作用可能與M2巨噬細胞相類似。后續(xù)實驗證明不同表型巨噬細胞與MGC-803細胞共培養(yǎng)后，M2型巨噬細胞促進胃癌細胞的侵襲和轉移，M1型巨噬細胞抑制胃癌細胞的侵襲和轉移；未激活的巨噬細胞Mφ更傾向于M2型巨噬細胞，對MGC-803細胞的侵襲和轉移有一定促進作用。因此，我們是否可以通過一定手段干預未激活的巨噬細胞向M1型巨噬細胞分化成為我們下一步實驗的主要研究目的。并且有研究表明在腫瘤發(fā)病的開始階段主要是M1型巨噬細胞被激活，大量的巨噬細胞對腫瘤細胞發(fā)生攻擊和殺傷作用，有效地抑制腫瘤細胞的轉移和擴散，但隨后因為巨噬細胞在腫瘤微環(huán)境所接觸到的細胞因子的不同(Th1或Th2細胞因子)及腫瘤細胞異質性和可塑性促使M1型巨噬細胞向M2型巨噬細胞即TAMs轉化，巨噬細胞不僅失去了殺傷腫瘤細胞的作用且?guī)椭[瘤細胞發(fā)生免疫逃逸及免疫抑制作用，促進腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉移[6]。因此推測：TAMs在晚期胃癌細胞微環(huán)境中主要是以替代激活的M2型巨噬細胞表型存在，對胃癌的侵襲轉移和擴散起促進作用，是導致其預后不佳的重要因素。

圖9～10 顯微鏡200倍鏡下觀察腫瘤相關巨噬細胞不同表型通過transwell實驗后遷移、侵襲至小室外的細胞計數(shù)Fig 9-10 Under a 200-fold microscope observed that after transwell experiments the number of different phenotypes of tumor-associated macrophages across migration and invasion

綜上所述，腫瘤相關巨噬細胞的異質性和可塑性為我們有效治療胃癌提供了一個可能的治療靶點，直接抑制腫瘤組織中巨噬細胞向M2型巨噬細胞即TAMs轉化，通過相關的途徑誘導TAMs向M1型巨噬細胞轉化，通過轉化成對腫瘤細胞有抑制作用的巨噬細胞進一步對腫瘤細胞發(fā)生直接殺傷作用，減少腫瘤細胞擴散和轉移的機會，有效地控制和治療胃癌。