劉燕群， 周中銀， 譚詩云

武漢大學(xué)人民醫(yī)院消化內(nèi)科 消化系疾病湖北省重點實驗室，湖北 武漢 430060

我國是胃癌高發(fā)地區(qū)，胃癌發(fā)病例數(shù)和死亡例數(shù)分別占全球胃癌發(fā)病和死亡的42.6%和45.0%，胃癌引起的死亡率高居各類惡性腫瘤死亡率的第3位[1-2]。早發(fā)現(xiàn)、早治療是提高胃癌患者療效及改善預(yù)后的關(guān)鍵。外科手術(shù)治療仍是胃癌治療的主要手段。然而，在臨床上，由于胃癌患者可能早期無明顯癥狀，即使有了上腹脹或不適等非特異性癥狀，因未予重視或懼怕胃鏡檢查等原因，導(dǎo)致很大一部分胃癌患者在臨床診斷時已屬中晚期，失去了手術(shù)價值。腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)是導(dǎo)致胃癌患者臨床治療失敗和死亡的主要原因。自噬是廣泛存在于真核細(xì)胞內(nèi)利用溶酶體降解自身受損的細(xì)胞器和大分子物質(zhì)的過程[3-4]，是細(xì)胞應(yīng)對惡劣環(huán)境的生存機制。研究證實，自噬與腫瘤的發(fā)生、增殖、侵襲轉(zhuǎn)移等關(guān)系密切[5]。

中藥重樓又稱七葉一枝花，是中醫(yī)抗腫瘤配方中常用的中藥。重樓皂苷Ⅰ是從中藥重樓中提取的一種甾體皂苷單體，藥理學(xué)研究證實其具有廣泛藥理學(xué)活性，包括免疫調(diào)節(jié)、清熱解毒、抗腫瘤、心血管作用等[6-7]。本實驗擬觀察重樓皂苷Ⅰ對胃癌細(xì)胞侵襲能力和自噬的影響，并探討其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1主要材料胃癌HGC-27細(xì)胞(中科院上海細(xì)胞庫)；重樓皂苷Ⅰ(中國藥品生物制品檢定所)；胎牛血清(碧云天生物技術(shù)研究所)；Matrigel膠(美國BD公司)；Transwell小室、細(xì)胞培養(yǎng)瓶、細(xì)胞培養(yǎng)皿、96孔及6孔培養(yǎng)板(Corning公司)；RPMI 1640培養(yǎng)液、辣根酶標(biāo)記山羊抗兔或山羊抗鼠IgG(武漢博士德生物科技有限公司)；蛋白濃度測定試劑盒(杭州碧云天生物技術(shù)研究所)；EMT標(biāo)志物抗體(E-cadherin、Vimentin、Fibronectin)、自噬相關(guān)基因Atg5、LC3-Ⅱ和Beclin1蛋白、MMP-9及內(nèi)參β-actin抗體(Cell Signaling Technology公司)。

1.2方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：HGC-27細(xì)胞在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2飽和濕度條件的恒溫箱中，用質(zhì)量濃度為100 g/L胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)。實驗均選用處于對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行。

1.2.2 Transwell法檢測細(xì)胞侵襲能力：實驗分為對照組(0 μmol/L 重樓皂苷Ⅰ)、5 μmol/L 重樓皂苷Ⅰ組、10 μmol/L重樓皂苷Ⅰ組和20 μmol/L 重樓皂苷Ⅰ組。在4 ℃融化Matrigel膠，于冰上將Matrigel用磷酸鹽緩沖液稀釋后鋪在小室內(nèi)，室溫放置10 min風(fēng)干后備用；取對數(shù)生長期的各組細(xì)胞，用不含血清的培養(yǎng)基重懸計數(shù)，加入200 μl于Transwell小室上室中(細(xì)胞密度為2×105ml-1)，將600 μl質(zhì)量濃度為100 g/L血清的培養(yǎng)基加入Transwell小室下室，37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)48 h，PBS洗滌3次，用PBS濕潤的棉簽輕輕拭小室內(nèi)的細(xì)胞，質(zhì)量濃度為40 g/L的多聚甲醛固定30 min，質(zhì)量濃度為1 g/L結(jié)晶紫染液室溫下染色15 min，顯微鏡下拍照，隨機取5個視野計數(shù)，統(tǒng)計結(jié)果。

1.2.3 蛋白質(zhì)印跡法檢測EMT標(biāo)志物、自噬相關(guān)基因蛋白及MMP-9表達(dá)：實驗分組及處理同上。消化收集細(xì)胞，加入200 μl預(yù)冷的含PMSF的蛋白裂解液，用移液器反復(fù)抽吸后震蕩1 min，4 ℃條件下裂解30 min，4 ℃條件下12 000 r/min離心10 min(離心半徑為5.5 cm)，將上清液小心移至經(jīng)高壓消毒的EP管內(nèi)，根據(jù)蛋白測定試劑盒說明書檢測蛋白質(zhì)濃度計算蛋白質(zhì)含量；采用蛋白質(zhì)印跡法檢測蛋白質(zhì)表達(dá)情況，取40 μg各組樣品行SDS-PAGE電泳，再轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，質(zhì)量濃度為50 g/L BSA封閉1 h，根據(jù)蛋白分子量切割條帶，分別加入一抗，室溫下孵育2 h，再次TBST洗膜，ECL顯色、曝光、顯影、定影、拍照并分析數(shù)據(jù)。

1.3統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，所有計量數(shù)值進(jìn)行正態(tài)性檢驗，均為正態(tài)分布，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩樣本間均數(shù)比較采用獨立樣本t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1重樓皂苷Ⅰ對胃癌細(xì)胞侵襲能力的影響0、5、10、20 μmol/L 重樓皂苷Ⅰ處理HGC-27細(xì)胞48 h后，Trasnwell結(jié)果顯示，隨著藥物濃度的增加，穿過Trasnwell小室基底膜的細(xì)胞數(shù)逐漸減少，與對照組(0 μmol/L)比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見圖1)。

2.2重樓皂苷Ⅰ對胃癌細(xì)胞MMP-9表達(dá)的影響0、5、10、20 μmol/L 重樓皂苷Ⅰ處理HGC-27細(xì)胞48 h后，蛋白質(zhì)印跡檢測結(jié)果顯示,隨著藥物濃度的升高，細(xì)胞MMP-9蛋白表達(dá)量逐漸降低(見圖2)。

2.3重樓皂苷Ⅰ對胃癌細(xì)胞EMT標(biāo)志物表達(dá)的影響本實驗進(jìn)一步探討了不同濃度重樓皂苷Ⅰ(0、5、10、20 μmol/L)對胃癌HGC-27細(xì)胞EMT標(biāo)志物表達(dá)的影響，隨著藥物濃度的升高，上皮標(biāo)記物E-cadherin蛋白表達(dá)量逐漸增加，同時，間葉標(biāo)記物Vimentin和Fibronectin蛋白表達(dá)量逐漸降低(見圖3)。

2.4重樓皂苷Ⅰ對胃癌細(xì)胞自噬相關(guān)基因Atg5、LC3-Ⅱ和Beclin1蛋白表達(dá)的影響重樓皂苷Ⅰ(0、5、10、20 μmol/L)處理HGC-27細(xì)胞48 h后，蛋白質(zhì)印跡檢測結(jié)果顯示,隨著藥物濃度的升高，自噬相關(guān)基因Atg5、LC3-Ⅱ和Beclin1蛋白表達(dá)量逐漸增加(見圖4)。

3 討論

近年來在腫瘤治療等方面取得了許多重大發(fā)展和進(jìn)步，新的抗腫瘤藥物或方案層出不窮，但胃癌患者生存率并未明顯提高。腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)是導(dǎo)致胃癌患者臨床治療失敗和死亡的主要原因，因此，新的方法和策略來抑制腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移成為腫瘤治療研究的重點。傳統(tǒng)中藥的抗腫瘤作用備受關(guān)注。本實驗中，細(xì)胞侵襲實驗結(jié)果顯示，重樓皂苷Ⅰ處理HGC-27細(xì)胞48 h后，隨著藥物濃度的升高，越過Transwell小室基底膜的細(xì)胞數(shù)逐漸減少。表明重樓皂苷Ⅰ可抑制胃癌HGC-27細(xì)胞侵襲能力。

研究證實，EMT是腫瘤原發(fā)性浸潤和繼發(fā)性轉(zhuǎn)移的重要機制。EMT是在胞外因素刺激下由上皮細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化為具有間質(zhì)細(xì)胞表型的過程[6]。在EMT 過程中，細(xì)胞極性、細(xì)胞間緊密連接和黏附連接逐漸喪失，肌動蛋白細(xì)胞骨架發(fā)生重組，細(xì)胞-細(xì)胞間連接蛋白如E-cadherin、γ-catenin等表達(dá)減少，而間葉標(biāo)記物如N-cadherin、Vimentin、Fibronctin等表達(dá)明顯增加；同時，基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteins，MMPs)如MMP-2、MMP-3及MMP-9等活性顯著增加，細(xì)胞被轉(zhuǎn)化為具有侵襲和運動能力的間葉樣細(xì)胞表型。本實驗中，重樓皂苷Ⅰ處理HGC-27細(xì)胞48 h后，蛋白質(zhì)印跡法檢測細(xì)胞EMT標(biāo)志物表達(dá)變化情況，結(jié)果顯示，上皮標(biāo)志物E-cadherin表達(dá)上調(diào)，同時間葉標(biāo)志物Vimentin和Fibronectin表達(dá)下調(diào)，且MMP-9表達(dá)下調(diào)，提示重樓皂苷Ⅰ處理后可抑制胃癌HGC-27細(xì)胞EMT。

注：與對照組比較，重樓皂苷Ⅰ處理后，穿過人工基底膜的HGC-27細(xì)胞數(shù)顯著減少，#P<0.05。圖1 重樓皂苷Ⅰ抑制胃癌HGC-27細(xì)胞侵襲能力 A: 0 μmol/L; B: 5 μmol/L; C: 10 μmol/L; D: 20 μmol/L; E: HGC-27細(xì)胞數(shù)Fig 1 Inhibition of invasion of gastric cancer HGC-27 cells by Polyphyllin Ⅰ A: 0 μmol/L; B: 5 μmol/L; C: 10 μmol/L; D: 20 μmol/L; E: the cell number of HGC-27

圖2 重樓皂苷Ⅰ對胃癌HGC-27細(xì)胞MMP-9蛋白表達(dá)的影響Fig 2 Effect of Polyphyllin Ⅰ on the expression of MMP-9 protein in HGC-27 cells of gastric cancer

自噬是廣泛存在于真核細(xì)胞內(nèi)利用溶酶體降解自身受損的細(xì)胞器和大分子物質(zhì)的過程[4,7]，是細(xì)胞應(yīng)對

圖3 重樓皂苷Ⅰ對胃癌HGC-27細(xì)胞EMT標(biāo)志物蛋白表達(dá)的影響Fig 3 Effect of Polyphyllin Ⅰ on the expression of EMT marker protein in gastric cancer HGC-27 cells

惡劣環(huán)境的生存機制。自噬在腫瘤發(fā)生、發(fā)展的過程中扮演著復(fù)雜又重要角色。自噬可通過維護(hù)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定阻止細(xì)胞癌變，但當(dāng)腫瘤形成后，因缺氧等不利因素，自噬可用于維持生存，有助于腫瘤細(xì)胞渡過不利的微環(huán)境，并能促進(jìn)惡性腫瘤的增殖和侵襲轉(zhuǎn)移[8]。本實驗發(fā)現(xiàn)重樓皂苷Ⅰ處理后，HGC-27細(xì)胞自噬相關(guān)基因Atg5、LC3-Ⅱ和Beclin1蛋白表達(dá)上調(diào)，提示HGC-27細(xì)胞自噬水平升高。

圖4 重樓皂苷Ⅰ對HGC-27細(xì)胞自噬相關(guān)基因Atg5、 LC3-Ⅱ和Beclin1蛋白表達(dá)量的影響Fig 4 Effect of Polyphyllin Ⅰ on the expressions of autophagy related genes Atg5, LC3-Ⅱ and Beclin1 in HGC-27 cells

綜上，重樓皂苷Ⅰ處理后，胃癌HGC-27細(xì)胞侵襲能力顯著降低，腫瘤細(xì)胞上皮標(biāo)記物E-cadherin表達(dá)降低，且間葉標(biāo)記物Vimentin、Fibronctin表達(dá)上調(diào)；同時，重樓皂苷Ⅰ處理后也可誘導(dǎo)HGC-27細(xì)胞發(fā)生自噬。提示重樓皂苷Ⅰ對胃癌HGC-27細(xì)胞自噬狀態(tài)及間質(zhì)化特征有著重要作用，且提示細(xì)胞自噬與細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化之間存在相互影響的關(guān)系，下一步我們將進(jìn)一步探討重樓皂苷Ⅰ誘導(dǎo)的自噬在胃癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用及機制，并闡明重樓皂苷Ⅰ誘導(dǎo)自噬的機制，為尋找新的抑制胃癌侵襲轉(zhuǎn)移治療方案及重樓皂苷Ⅰ在胃癌中的臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。