徐瑾 李衛(wèi)紅 陳國斌

作者單位：518028 深圳市婦幼保健院婦科

子宮頸癌是常見的婦科惡性腫瘤, 我國每年約有超過100000的新發(fā)病例, 是嚴重危害女性健康的常見惡性腫瘤［1］。化療是宮頸癌的重要治療方式, 以鉑類藥物為基礎的化療是宮頸癌化療的一線選擇, 其中順鉑是常用的宮頸癌化療藥物［2］。腫瘤細胞耐藥可致化療欠佳, 使患者得不到有效的治療而死于癌癥；化療藥物耐藥是目前腫瘤治療面臨的難題, 但腫瘤耐藥的機制目前尚不清楚。惡性腫瘤細胞由于生長迅速而使細胞微環(huán)境處于缺氧狀態(tài), 缺氧可使瘤細胞對化療的抗性增加, 故目前研究認為腫瘤細胞微環(huán)境缺氧是腫瘤產生耐藥的重要原因［3,4］。缺氧誘導因子1α(hypoxia induced factor 1α, HIF-1α)是細胞在缺氧狀態(tài)下穩(wěn)定表達的核轉錄因子, 可在轉錄水平調控諸多靶基因的表達從而導致腫瘤細胞的化療耐藥, 已報道與多種惡性腫瘤鉑類耐藥有關［4,5］。但在宮頸癌方面研究報道較少, 本研究擬siRNA沉默宮頸癌Hela細胞的HIF-1α基因, 觀察缺氧培養(yǎng)條件下hela細胞對順鉑的敏感性, 探討宮頸癌順鉑耐藥的機制, 為減少宮頸癌化療耐藥提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 順鉑(上海阿拉丁生化科技股份有限公司), Lipofectamine3000(Invitrogen), CCK-8(上海碧云天),RT-PCR試劑盒(TAKARA), HIF-1α試劑盒(Abcam),AnnexinV-FITC-FITC/PI凋 亡 檢 測 試 劑 盒 (solarbio)。HIF-1α siRNA 由上海吉瑪制藥技術有限公司合成, 包含1條目的 siRNA鏈和1條陰性對照, si-HIF-1α：Forward：5’GATCCCGCACAGTTACAGTA TTCCATCA AGAGTG GAATACTGTAACTGTGCTTTITT-3’, Reverse：5’-CTAGAAAAAAGCACA GTTACAGTATCCACTCTTGATGGAAT ACTGTAACTGTGCGG-3’。引物由上海生工合成。三氣培養(yǎng)箱(NU4950型), 熒光定量PCR儀(BIO-RAD), 酶標儀(美國BIO TEK), 流式細胞儀 (BIO-RAD), 超靈敏度化學發(fā)光成像系統(tǒng)(BIO-RAD)。

1.2 細胞培養(yǎng) 宮頸癌細胞株Hela細胞購于中國科學院上海生命科學研究院生物化學與細胞生物學研究所細胞庫, 用含10%胎牛血清的RPMI Medium 1640 basic培養(yǎng)基培養(yǎng), 青霉素和鏈霉素濃度均為100 U/ml, 在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 細胞轉染及處理 將Hela 細胞接種于6孔板中, 待細胞融合達到40～50%時, 每孔加入900 μl Optimen@I Medium。將 3 μl的 Lipofectamine3000 和 5 μl的 siRNA 分別與 50 μl的Optimen@I Medium輕輕混勻, 靜置 5 min, 然后將上述混合液輕輕混勻, 靜置20 min后分別加入相應實驗分組中。實驗分四組：①正常氧培養(yǎng)組(對照組)②低氧組(單純低氧培養(yǎng)) ③低氧陰性對照組(低氧培養(yǎng)并轉染siRNA陰性對照鏈)④實驗組(低氧培養(yǎng)并轉染si-HIF-1α鏈)。

1.4 WB 和RT-PCR檢測HIF-1α蛋白及其mRNA 將1.3轉染的細胞培養(yǎng)48 h后收集, Trizol法提取mRNA,RT-PCR法檢測mRNA含量, HIF-1α引物：Forward：5’GCCAGATGATC ATGCAGCTACT-3’, Reverse ：5’-TGCTCCCTTCCATTCTGTTCAC-3’, 按試劑盒說明進行操作。72 h后收集細胞, RIPA裂解液提取蛋白, PAGE凝膠電泳分離蛋白, PVDF轉膜, 5%脫脂牛奶封閉, HIF-1α抗體封閉過夜, 二抗孵育1 h后上機顯影。

1.5 CCK-8法檢測Hela細胞的藥物敏感性 將1.3轉染的細胞制成懸液, 以1×105/ml 的細胞密度接種于96孔板, 每孔加入100 μl細胞懸液, 每組設5個復孔, 培養(yǎng)72 h后分別加入含 2、4、8、16、32 μg/ml 順鉑的培養(yǎng)液 100 μl, 24 h 后每孔加入10 μl CCK-8, 培養(yǎng)箱內孵育2 h后酶標儀上測定450 nm處的吸光度值(OD), 據平均OD值計算出藥物IC50。

1.6 CCK-8法檢測順鉑對腫瘤細胞增殖的影響 將1.3轉染的細胞制成懸液, 以5×104/ml 的細胞密度接種于96孔板,每孔加入100 μl細胞懸液, 每組設5個復孔, 培養(yǎng)24 h待細胞貼壁加入含5 μg/ml順鉑的完成培養(yǎng)基100 μl, 分別于藥物作用的0、24、48、72、96 h行CCK-8檢測, 每孔加入10 μl CCK-8, 培養(yǎng)箱內孵育1 h后酶標儀上測定450 nm處的吸光度值(OD), 根據OD值計算細胞生長抑制率。

1.7 流式細胞儀檢測細胞凋亡率 將1.3轉染的細胞制成懸液, 以2×105/ml 的細胞密度接種于6孔板, 每孔加入1 ml細胞懸液, 培養(yǎng)72 h后加入含5 μg/ml順鉑的完成培養(yǎng)基1 ml,藥物作用24 h后去除培養(yǎng)液, PBS洗滌2次后加不含EDTA的胰酶消化細胞, 離心后PBS洗滌2次加入Binding Buffer重懸細胞 , 加入 10 μl Annexin V-FITC 和 5 μl Popidium Iodide,輕輕混勻, 室溫避光孵育15 min后上機檢測。

1.8 統(tǒng)計學方法 采用SPSS20.0統(tǒng)計學軟件進行數據分析。計量資料以均數±標準差(±s)表示, 采用t檢驗；計數資料以率(%)表示, 采用χ2檢驗或Kruskal-Wallis檢驗。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 不同氧濃度度培養(yǎng)下Hela細胞HIF-1α表達及細胞增殖 HIF-1α是細胞缺氧狀態(tài)下表達的核轉錄因子。HIF-1α在15%、10%和5%氧濃度培養(yǎng)下其蛋白表達明顯增加。HIF-1α mRNA在低氧培養(yǎng)下高表達, 20%氧濃度組明顯低于15%、10%和5%組, 差異均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。15%氧濃度高于5%組, 差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。15%氧濃度高于10%組, 差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。在細胞增殖方面, 適度缺氧可以促進細胞增殖,CCK8檢測示15%和10%氧濃度培養(yǎng)其OD值明顯高于20%氧濃度培養(yǎng), 在72 h后差異均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。而過度的缺氧可抑制細胞增殖, 5%氧濃度培養(yǎng)其OD值明顯低于20%、15%和10%氧濃度培養(yǎng)。而15%和10%氧濃度培養(yǎng), 72 h前兩組比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05), 但96 h后15%氧濃度組OD值高于10%氧濃度組, 差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。見圖1。因此本實驗選擇15%氧濃度作為后續(xù)實驗的缺氧培養(yǎng)。

2.2 si-HIF-1α處理后HIF-1α蛋白及其mRNA的表達對照組HIF-1α蛋白表達較低, 而低氧組和低氧陰性對照組HIF-1α蛋白表達明顯升高, 實驗組si-HIF-1α轉染后低氧培養(yǎng)其HIF-1α蛋白表達明顯下降, 低于低氧組和低氧陰性對照組, 差異均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。HIF-1αmRNA在低氧組和低氧陰性對照組表達明顯高于對照組, 差異均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。實驗組si- HIF-1α轉染后低氧培養(yǎng)其HIF-1αmRNA表達明顯下降, 低于低氧組和低氧陰性對照組, 差異均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05), 而實驗組HIF-1αmRNA表達高于對照組, 差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。見圖2。

2.3 不同氧濃度培養(yǎng)下Hela細胞的順鉑IC50 20%氧濃度組IC50明顯低于15%、10%和5%組, 差異均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。15%和5%氧濃度組IC50高于10%組, 三組比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。后期實驗選擇順鉑濃度為6 μg/ml。見表 1。

2.4 si-HIF-1α處理后Hela細胞缺氧下順鉑對Hela細胞的IC50 對照組IC50明顯低于低氧組和低氧陰性對照組, 差異均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05), 低氧陰性對照組IC50高于低氧組, 但差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。低氧陰性對照組IC50高于實驗組, 差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。見表2。

2.5 缺氧培養(yǎng)下順鉑對Hela細胞的活性抑制 順鉑對Hela細胞的抑制隨時間梯度逐漸增加, 在低氧培養(yǎng)48 h內各組間順鉑對細胞的生長抑制率差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)；72、96 h低氧組及低氧陰性對照組細胞生長抑制率明顯低于對照組, 實驗組細胞生長抑制率高于低氧組及低氧陰性對照組,差異均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；72、96 h實驗組細胞生長抑制率低于對照組, 但差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。見表3。

2.6 低氧下順鉑對Hela細胞凋亡的影響 低氧組及低氧陰性對照組順鉑刺激24 h后細胞凋亡率分別為20.7%、23.7%,低于對照組的40.8%及實驗組的37.6%, 差異具有統(tǒng)計學意義 (P＜0.05)。見圖 3, 圖 4。

圖1 不同氧濃度培養(yǎng)Hela細胞HIF-1α表達及其細胞增殖

圖2 不同組別Hela細胞HIF-1α表達

表1 不同氧濃度培養(yǎng)下Hela細胞的順鉑IC50值比較( ±s, μg/ml)

表1 不同氧濃度培養(yǎng)下Hela細胞的順鉑IC50值比較( ±s, μg/ml)

注：與20%O2組比較, aP＜0.05

組別 IC50 20%O2組 4.79±0.23 15%O2組 6.04±0.27a 10%O2組 5.78±0.20a 5%O2組 6.03±0.62a

表2 不同組別Hela細胞的順鉑IC50值比較( ±s, μg/ml)

表2 不同組別Hela細胞的順鉑IC50值比較( ±s, μg/ml)

注：與對照組比較, aP＜0.05；與低氧組比較, bP＞0.05；與實驗組比較,cP＜0.05

組別 IC50對照組 4.76±0.75低氧組 6.84±1.12a低氧陰性對照組 6.88±0.86bc實驗組 5.64±0.61

表3 不同時間順鉑對Hela細胞的生長抑制率( ±s, %)

表3 不同時間順鉑對Hela細胞的生長抑制率( ±s, %)

注：與對照組比較, aP＜0.05；與實驗組比較, bP＜0.05

組別 0 h 24 h 48 h 72 h 96 h對照組 0.8±0.11 10.2±1.64 19.8±1.64 31.8±4.14 39.0±3.81低氧組 0.6±0.89 10.0±1.58 17.0±1.58 24.2±3.56ab 27.4±2.30ab低氧陰性對照組 1.0±1.0 9.6±2.07 17.8±1.64 25.2±3.83ab 27.8±2.87ab實驗組 0.6±0.89 10.2±0.84 19.6±1.34 30.2±1.30 34.1±4.3

圖3 低氧下順鉑對Hela細胞凋亡的影響

圖4 不同組別低氧下順鉑對Hela細胞凋亡比較

3 討論

宮頸癌是常見的婦科惡性腫瘤, 嚴重危害女性的健康,我國每年約有27000人因宮頸癌而死亡, 提高宮頸癌的療效和減少因癌致死率是目前臨床上亟待解決的問題［1］?；熓菍m頸癌重要治療的方法, 化療有高危因素、腫瘤復發(fā)、轉移或者晚期宮頸癌患者必不可少的治療, 以順鉑為基礎的化療或者同步放化療可提高宮頸癌患者的5年生存率, 使宮頸癌患者的死亡風險下降28%～50%, 尤其對于晚期或者全身多處轉移的患者［6］。順鉑為鉑的金屬絡合物, 可作用于DNA形成順鉑/DNA復合物從而破壞DNA的復制, 或與核蛋白結合導致DNA損傷, DNA復制障礙或損傷可通過P53、促分裂原活化蛋白激酶等介導細胞凋亡信號的激活, 從而導致細胞凋亡或細胞增殖抑制［7］。然而, 鉑耐藥是宮頸癌臨床治療中不可忽視的問題, 鉑耐藥是中晚期宮頸癌治療失敗因癌致死的原因之一［8］。腫瘤耐藥可能與腫瘤微環(huán)境低氧狀態(tài)有關, 腫瘤在發(fā)生、發(fā)展過程中不斷的分裂增殖, 瘤體不斷增大, 而瘤體周圍血管不能相應提供足夠的血供造成腫瘤細胞缺血缺氧, 腫瘤細胞為適應低氧微環(huán)境改變而表達缺氧誘導因子(HIF), HIF誘導下游基因表達使腫瘤細胞適應缺氧［9］。HIF-1α是HIF的氧調節(jié)亞單位, 是細胞低氧環(huán)境下發(fā)揮作用的重要核轉錄因子, 可在轉錄水平調控多個靶基因, 從而導致腫瘤耐藥的產生, 目前已報道HIF-1α與多種腫瘤耐藥相關［10,11］。但關于HIF-1α與宮頸癌順鉑耐藥的研究報道較少, 本研究擬低氧條件下培養(yǎng)宮頸癌Hela細胞, 觀察低氧培養(yǎng)條件Hela細胞對順鉑的敏感性, 探討HIF-1α與低氧誘導的耐藥的關系。課題組將Hela細胞于低氧條件下培養(yǎng)48 h和72 h后分別檢測HIF-1α蛋白及其mRNA的表達, 結果顯示HIF-1α蛋白及其mRNA在低氧培養(yǎng)條件下明顯表達, 而正常氧培養(yǎng)下表達不明顯, 說明HIF-1α是細胞受缺氧刺激而特異性表達的, 這與Kourti等［12］報道一致。但HIF-1α與Hela細胞順鉑耐藥有何關聯, 課題組將Hela細胞低氧培養(yǎng)72 h后加入順鉑并檢測其IC50, 結果顯示低氧組IC50明顯高于對照組(P＜0.05), 實驗組通過siRNA技術沉默HIF-1α基因后, 其IC50明顯低于低氧陰性對照組(P＜0.05), 由此可見低氧培養(yǎng)下Hela細胞合成的HIF-1α與順鉑耐藥密切相關, 在其他腫瘤研究中亦有報道, GU等［13］通過siRNA技術敲除前列腺癌PC-3細胞的HIF-1α基因發(fā)現其提高順鉑的抗癌性。課題組進一步研究低氧與Hela細胞耐藥的時間關系,觀察不同培養(yǎng)條件下Hela細胞在相同順鉑濃度作用下的生長抑制情況, 在順鉑用藥的48 h內各組間Hela細胞生長抑制率差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05), 但72、96 h低氧組和低氧陰性對照組其細胞生長抑制率明顯低于對照組(P＜0.05), 而實驗組由于通過基因技術敲除HIF-1α, 其生長抑制率明顯低于低氧陰性對照組(P＜0.05), 從時間梯度可見隨低氧培養(yǎng)時間的延長Hela細胞表達HIF-1α明顯增加, HIF-1α的表達可促進Hela細胞對順鉑耐藥。耐藥可抑制腫瘤細胞的凋亡, 腫瘤細胞在化療藥物的作用下仍可繼續(xù)增殖, 課題組進一步研究低氧對Hela細胞凋亡的影響, 將Hela細胞低氧培養(yǎng)72 h后加入順鉑, 24 h后流式細胞儀檢測Hela細胞凋亡, 結果顯示低氧組及低氧陰性對照組其凋亡率均明顯低于實驗組和對照組(P＜0.05), 由此可見低氧可抑制順鉑誘導的Hela細胞凋亡, 而抑制凋亡的機制與細胞低氧下表達的HIF-1α相關。

綜上所述, 本研究認為Hela細胞在低氧條件表達HIF-1α,HIF-1α可促進細胞對順鉑的耐藥, 抑制細胞凋亡, 從而促進腫瘤繼續(xù)增殖；而敲除HIF-1α基因的表達可抑制低氧誘導的順鉑耐藥, HIF-1α與Hela細胞的化療藥物耐藥密切相關, 阻斷HIF-1α的表達對于提高化療藥物的腫瘤抗性具有重要的意義。但HIF-1α是通過何種機制介導Hela細胞順鉑耐藥, 其機制尚不清楚, 將在后續(xù)的實驗進一步研究。