劉艷枚 楊夢(mèng) 劉倩 周鵬 周美芳 尹衛(wèi)國(guó) 黃振勇 禤淑霞 李介華

作者單位：511500 清遠(yuǎn)市人民醫(yī)院

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)是一種雙鏈DNA病毒, 引起以肝臟病變?yōu)橹鞯囊倚透窝? 隨著疫苗大力推廣,世界范圍內(nèi)HBV感染增長(zhǎng)速度明顯減慢, 但仍為我國(guó)最流行、危害最嚴(yán)重的一種傳染?。?］?？共《局委熓强刂坪皖A(yù)防慢性進(jìn)展的唯一選擇, 4 類核苷和核苷酸類藥物(nucleoside and nucleotide analogs, NAs)是目前臨床治療慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B, CHB)患者的主要藥物, 但常發(fā)生HBV對(duì)NAs的耐藥, 導(dǎo)致治療失敗和疾病進(jìn)展［2］。本院引進(jìn)一項(xiàng)用于HBV耐藥基因檢測(cè)項(xiàng)目, 采用基因芯片法檢測(cè)HBV常見(jiàn)8個(gè)耐藥位點(diǎn), 本研究為更好的評(píng)價(jià)該項(xiàng)技術(shù)的靈敏度和特異性, 選用臨床常用Nas藥物L(fēng)AM、ADV的3個(gè)常見(jiàn)耐藥位點(diǎn)rt204、rt181、rt236進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 材料 選取2015年1月～2016年8月來(lái)本院門急診就治的 210例CHB 患者, 入選條件：①符合《病毒性肝炎防治方案》中CHB的診斷標(biāo)準(zhǔn)；②使用LAM或(和)ADV治療＞1年；③血清中存在乙肝e抗原(HBeAg)和乙肝病毒脫氧核糖核酸(HBV-DNA), 且通過(guò)實(shí)驗(yàn)室確證患者血清樣本中HBV-DNA載量＞1.0×103 IU/ml, 均知情同意本研究, 經(jīng)過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn), 分離血清樣本放置-20℃下保存。

1.2 方法

1.2.1 試劑及儀器 HBV耐藥突變基因檢測(cè)試劑盒由亞能生物技術(shù)(深圳)有限公司提供, 主要檢測(cè)儀器有Life Express基因擴(kuò)增儀、eppendorf高速離心機(jī)、FYY-3型分子雜交儀、BioBase生物安全柜, 一代測(cè)序篩選部分外送凱普生物技術(shù)有限公司完成。

1.2.2 基因擴(kuò)增 取 200 μl 血清, 經(jīng)過(guò)裂解液將 HBV-DNA釋放, 無(wú)水乙醇和W液洗滌, TE液溶解, 取5 μl基因產(chǎn)物進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)反應(yīng), 反應(yīng)條件為：50℃、95℃10 min ；94℃ 60 s, 68℃ 30 s , 30 循環(huán) ；94℃ 30 s、54℃ 30 s、72℃ 30 s, 48 循環(huán) ；72℃ 5 min, 擴(kuò)增完成。

1.2.3 基因芯片雜交 將擴(kuò)增的DNA產(chǎn)物進(jìn)行變性, 放入芯片上進(jìn)行雜交, 芯片上包含rt204、rt181、rt 236位點(diǎn)的所有的野性型和突變型, 待芯片雜交完成后在光學(xué)分析儀上進(jìn)行掃描。

1.3 觀察指標(biāo) ①測(cè)序法檢測(cè)基因突變結(jié)果；②基因芯片檢測(cè)的靈敏度、特異性。靈敏度=真陽(yáng)性/(真陽(yáng)性+假陰性),特異性=真陰性/(真陰性+假陽(yáng)性),

2 結(jié)果

2.1 測(cè)序法檢測(cè)基因突變結(jié)果 210例CHB患者中, 測(cè)序法檢測(cè)出rt204位點(diǎn)突變者42例、檢出率為20.00%, rt181位點(diǎn)突變者24例、檢出率為11.43%, rt236位點(diǎn)突變者18例、檢出率為8.57%, 未發(fā)生突變者為126例。雖然CHB患者主要以LAM耐藥基因rt204位點(diǎn)突變?yōu)橹? 但是 ADV耐藥基因rt181、rt236也發(fā)生了一定程度上的突變(見(jiàn)表1, 圖1)。

2.2 基因芯片檢測(cè)的靈敏度、特異性 210例CHB患者中,基因芯片檢測(cè)發(fā)現(xiàn)204位點(diǎn)突變者44例, 181位點(diǎn)突變者25例, 236位點(diǎn)突變者21例?；蛐酒夹g(shù)檢測(cè)HBV基因rt204位點(diǎn)突變的靈敏度為95.24%, 特異性為97.62%；rt181位點(diǎn)突變的靈敏度為91.67%, 特異性為98.39%；rt236位點(diǎn)突變的靈敏度為94.44%, 特異性為97.92%, 均達(dá)到高的靈敏度和特異性(見(jiàn)表1, 圖1)。

表1 兩種技術(shù)檢測(cè)HBV基因突變情況(n, n=210)

圖1 測(cè)序法檢測(cè)HBV耐藥基因圖注：該患者體內(nèi)HBV基因的rt204M位點(diǎn)突變?yōu)閞t204I

3 討論

臨床治療CHB主要采用核苷和核苷酸類藥物, 但在治療過(guò)程中很容易發(fā)生基因突變引起耐藥, 常用Nas藥物L(fēng)AM, 在選擇性壓力下最常見(jiàn)HBV-DNA 聚合酶的酪氨酸-蛋氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸(YMDD)變異, 即由YMDD變異為YIDD(rtM204I)或YVDD(rtM204V), 使LAM與HBVDNA 聚合酶的親合力下降或消失, 變異的HBV逐漸成為對(duì)LAM耐藥的優(yōu)勢(shì)株。對(duì)于CHB患者, 耐藥是一個(gè)極為嚴(yán)重的打擊, 不僅增加發(fā)生肝功能失代償和肝細(xì)胞癌(HCC)的風(fēng)險(xiǎn)而加速疾病進(jìn)展, 同時(shí)還會(huì)加大后續(xù)治療的難度, 增加長(zhǎng)期治療的醫(yī)療成本［3,4］。

目前在臨床上對(duì)于耐藥基因的檢測(cè)尚無(wú)統(tǒng)一的規(guī)范［5,6］,PCR-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)分析、肽核酸介導(dǎo)的PCR鉗制連接酶檢測(cè)反應(yīng)、微陣列、質(zhì)譜分析等技術(shù), 高度可靠但耗時(shí)長(zhǎng), 需要熟練的技術(shù)人員來(lái)執(zhí)行［5-8］。直接HBV-DNA的測(cè)序被認(rèn)為是檢測(cè)LAM、ADV耐藥HBV突變基因的金標(biāo)準(zhǔn), 但它是一種耗時(shí)且費(fèi)力的方法, 僅在突變病毒占病毒總數(shù)的至少25%時(shí)檢測(cè)突變病毒［9,10］。基因芯片是一項(xiàng)基于PCR技術(shù)和反向斑點(diǎn)印跡(RDB)法并同時(shí)檢測(cè)多個(gè)突變位點(diǎn)的技術(shù), 在rt204、rt181、rt236位點(diǎn)突變的靈敏度達(dá)到90%以上, 特異性甚至達(dá)到98%以上, 但有趣的是基因芯片法在rt204、rt181、rt236三個(gè)位點(diǎn)陽(yáng)性檢出率均比測(cè)序法高, 可能的原因有其檢測(cè)線低, 可檢測(cè)出5%以上突變病毒, 靈敏度可能比直接測(cè)序法高。

綜上所述, 基因芯片技術(shù)作為一種操作簡(jiǎn)單、高敏感和特異性分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù), 有望推廣成為HBV耐藥基因檢測(cè)的一種便捷、精準(zhǔn)的檢測(cè)方法, 為廣大CHB患者提供及時(shí)、有效的耐藥監(jiān)測(cè)。