孟 新 侯 佳 王 瑩 劉俐嬪 劉璐瑤 劉丹如 孫金嶠 王曉川

1 病例報告

男，6歲5月，發(fā)現(xiàn)粒細胞減少6年余，為求進一步診治，于2018年4月就診于復旦大學附屬兒科醫(yī)院(我院)臨床免疫科。

既往史：患兒3月齡時因發(fā)熱查血常規(guī)，首次發(fā)現(xiàn)WBC及中性粒細胞絕對計數(shù)(ANC)減少，其后6年間斷隨訪血常規(guī)，WBC及ANC始終低于正常水平?；純浩剿匾壮霈F(xiàn)無明顯誘因發(fā)熱，頻率約每月1次，熱峰39℃左右，熱型不規(guī)則，對癥處理后發(fā)熱可緩解；反復發(fā)生上呼吸道感染、化膿性扁桃體炎、口腔潰瘍，感染病原包括白色念珠菌、EB病毒、肺炎支原體。先后使用多種抗感染藥物，包括阿奇霉素、美羅培南、哌拉西林他唑巴坦、頭孢菌素類(包括頭孢哌酮他唑巴坦、頭孢唑肟、頭孢他啶、頭孢唑林、頭孢尼西)，抗感染治療后病情好轉。3歲時于外院行骨髓細胞形態(tài)學檢測，提示骨髓增生活躍低水平，粒系成熟障礙。曾注射重組人集落刺激因子(G-CSF)，效果不詳。無乙肝、結核、傷寒等傳染病史及其接觸史，有芒果過敏史，無藥物過敏史，無手術外傷史，無異物吸入史。

個人史：G1P1，足月順產，出生體重3.2 kg，Apgar評分1、5 min均為10分。生后母乳喂養(yǎng)，4月齡起添加雞蛋黃、粥等輔食，現(xiàn)普食，無挑食、偏食。2個月會抬頭，6個月會坐，13個月會走，智力、體格發(fā)育同正常同齡兒。

預防接種史：未按時接種，就診前已全部補種，未見不良反應。

家族史：父母體健，非近親婚配，否認家族性遺傳性疾病史。

體格檢查：T 36.5℃，P 100·min-1,R 22·min-1，體重21 kg。神志清楚，精神可，發(fā)育正常，營養(yǎng)中等。全身皮膚未見皮疹、出血點及黃染。淺表淋巴結未及腫大。外耳道無分泌液，乳突區(qū)無壓痛。唇紅，口腔黏膜光滑，咽部充血，雙側扁桃體I°腫大，充血，無膿苔。呼吸平穩(wěn)，雙肺呼吸音粗，未聞及啰音。心率100·min-1，律齊，心音有力。腹平軟，未及包塊，肝脾肋下未觸及，腸鳴音2～3·min-1。四肢末端溫，脊柱、四肢無畸形?？耸险?、布氏征、巴氏征陰性。

實驗室檢查：2017年8月17日至2018年5月30日共行21次血常規(guī)檢查，其中WBC(2.15±0.5)×109·L-1，ANC(0.261±0.086)×109·L-1，患兒于2018年4月29日至5月30日每2周隨訪血常規(guī)，ANC未見周期性波動(圖1)。淋巴細胞亞群分類計數(shù)示NK細胞減少(23.42×109·L-1，1.63%)。骨髓細胞學染色(圖2)：骨髓有核細胞增生活躍低水平，粒紅比為1.4∶1；粒系增生伴成熟障礙，部分細胞內可見顆粒增粗或可見空泡；紅系及淋巴系細胞增生活躍，形態(tài)無明顯異常；巨核細胞易見，血小板不少，簇狀易見。

根據(jù)患兒臨床表現(xiàn)，ANC減少、骨髓細胞形態(tài)學特點，臨床懷疑先天性中性粒細胞減少癥。外院血液遺傳疾病基因篩查，提示W(wǎng)AS基因突變，致病性不確定。為進一步明確診斷，經(jīng)患兒家長同意，對患兒及其父母進行WAS基因檢測。

圖1 WBC和ANC波動圖

圖2骨髓細胞形態(tài)學染色(瑞氏染色，×1000)示粒系成熟障礙

注 紅色箭頭示早幼粒細胞和中幼粒細胞

WAS基因Sanger測序驗證：取患兒及父母新鮮肝素抗凝血各2 mL，用FlexiGene DNA Kit抽提全血基因組DNA，測DNA濃度約100 ng·μL-1，設計WASexon8-exon9上下游PCR擴增引物，PCR擴增WAS基因，HiSeq2000進行Sanger測序，F(xiàn)inchTV軟件對結果進行分析(圖3)?；純篨染色體9號外顯子c.T881C(p.I294T)半合子變異，其母為攜帶者，其父該位點未發(fā)現(xiàn)變異。

WASmRNA檢測：取患兒及父母新鮮肝素抗凝血各2 mL，分離PBMC(人外周血淋巴細胞分離液，購自天津灝洋生物)，Trizol法提取總RNA并檢測RNA濃度后，逆轉錄成cDNA(PrimeScriptTMRT Master Mix，Takara)，設計qPCR引物(Forward Primer 5’-AGGTCGGAGTCAACGGATTT-3’; Reverse primer 5’-TTCCCGTTCTCAGCCTTGAC-3’)，qPCR采用Takara TerraTMqPCR Direct SYBR?Premix推薦方案，Roche Light Cycler實時熒光定量PCR儀檢測患兒及其父母WAS基因mRNA表達水平。以患兒父親為正常對照，將其qPCR結果2-△△Ct設為1，母親(攜帶者)為正常對照的0.60倍，患兒僅為正常對照的0.29倍，表明WAS基因p.I294T變異導致患兒該基因轉錄相對減少，攜帶者母親的mRNA表達水平亦下降。

圖3家系Sanger測序結果

注 黃色標記顯示患兒c.T881C:p.I294T半合子變異，其母為攜帶者，其父該位點未發(fā)現(xiàn)變異

流式細胞術檢測WASP表達：取患兒、患兒母親及健康人新鮮血各1管，肝素抗凝分離PBMC，F(xiàn)ACS buffer洗滌后與CD3抗體4℃孵育20 min，F(xiàn)ACS buffer洗滌，加入250 μL FACS Staining Buffer重懸混勻，加入500 μL Cytofix/Cytoperm置于4℃反應30 min，Perm/Wash液洗滌，50 μL Perm/Wash液重懸后加入WASP抗體，4℃反應20 min，Perm/Wash液終止染色并洗滌，200 μL FACS buffer重懸后流式細胞儀檢測WASP表達，F(xiàn)lowJo 軟件進行數(shù)據(jù)分析。圖4顯示，患兒、母親及正常對照細胞內WASP表達水平分別為74.5%、84.3%和93.7%。

圖4患兒及其母親WASP表達

注 A圖為設門方法，B圖為患兒、其母親和正常對照的WASP表達結果

治療與隨訪：患兒入我院后感染癥狀不明顯，ANC低，予粒細胞集落刺激因子(G-CSF)后ANC可從0.14×109·L-1上升至1.25×109·L-1，最高可升至3.32×109·L-1，隨訪1周后外周血ANC再次下降。隨訪至2018年9月，患兒病情穩(wěn)定，發(fā)熱和感染次數(shù)減少，外周血常規(guī)ANC(0.17～0.33)×109·L-1。

2 文獻復習

檢索PubMed、中國知網(wǎng)、萬方和維普數(shù)據(jù)庫，檢索時間從建庫至2018年9月20日。英文檢索關鍵詞為“X-linked neutropenia”，檢出542篇；中文檢索關鍵詞為“X連鎖中性粒細胞減少癥”，檢出0篇。篩選WAS基因突變導致的XLN病例的相關文獻23篇，排除重復報道病例后，共2個家系(比利時和愛爾蘭)和3例散發(fā)病例(剛果民主共和國和日本各1例，另1例國別不詳)，總計18例，共發(fā)現(xiàn)4個突變位點(L270P、S272P、I290T、I294T)[1-4,]，2001年歐洲報道了第1個XLN家系，2018年日本報道了第1例亞洲XLN病例[5]。

對國外報道的本文18例及本文患兒(共19例)進行了臨床資料總結和分析(表1)。患者均為男性，Sanger測序均發(fā)現(xiàn)WAS基因GBD結構域突變，ANC減少占84.2%(16/19)，其中15例<0.5×109·L-1，單核細胞數(shù)量減少(13/18，72.2%)，WBC數(shù)量降低(9/14，64.3%)。淋巴細胞亞群分析顯示，NK細胞數(shù)量均明顯降低(16/16)，CD8+T細胞升高(7/16，43.7%)、CD4+/CD8+比值倒置(9/16，56.3%)。6例(54.5%)骨髓細胞學存在粒系成熟障礙，其中2例伴有染色體核型異常，2例伴紅系/淋巴系發(fā)育異常，余2例僅有粒系成熟障礙。WAS基因功能獲得性突變臨床上主要表現(xiàn)為反復細菌感染(11/17, 64.7%),3例頻率可達每年8～10次，1例表現(xiàn)為不明原因發(fā)熱、2例無癥狀、3例ANC正常?；颊呋蛲蛔兂Ｓ诔赡旰蟀l(fā)現(xiàn)(10/14, 71.4%)，此前僅2例患者在兒童期即發(fā)現(xiàn)基因異常[5]，但其ANC處于正常水平，不能診斷為XLN。本文患兒是確診年齡最小的XLN患者。

3 討論

WAS基因突變常導致經(jīng)典的Wiskott-Aldrich綜合征(WAS)，以PLT減少伴體積縮小、濕疹及反復感染為臨床特征，病情常較危重，多因嚴重感染和出血而死亡[6]。WAS基因突變還可導致臨床表型較輕的X-連鎖血小板減少癥(XLT)和X連鎖中性粒細胞減少癥(XLN)。相關疾病不同臨床表型與WAS基因突變類型不同有關，無義突變和缺失突變導致WAS蛋白(WASP)表達缺失，引起嚴重的WAS綜合征；錯義突變導致WASP表達減少，引起XLT或者較輕的WAS綜合征；WAS基因功能獲得性突變則會引起XLN[7, 8]。XLN較其他兩種疾病表型罕見。

表1 WAS基因功能獲得性突變患者的臨床特征

注 G-CSF：粒細胞集落刺激因子；MDS：骨髓增生異常綜合征；NA：未檢查；URTI：上呼吸道感染；AML：急性髓細胞白血?。籄NC：中性粒細胞絕對計數(shù)；WBC：×109·L-1；N：中性粒細胞；M：單核細胞；L：淋巴細胞

WASP可調節(jié)細胞內肌動蛋白骨架生成，從而參與多種細胞生命過程，如細胞遷移、黏附聚集、分裂增殖等。WAS蛋白家族包括WASP、N-WASP、Scar/WAVE和Bee1，分別具有不同的組織特異性表達，其中WASP僅在血液系統(tǒng)表達。WASP在非激活狀態(tài)下，C端的VCA結構域與GBD結構域結合，稱為WASP的自身抑制。Cdc42是Rho家族成員，具有GTP酶活性，通過與GBD結構域結合激活WASP和N-WASP[9]。當VCA與GBD結合被Cdc42破壞后，WASP游離C端通過激活Arp2/3復合體[10]，進而促進肌動蛋白聚合[11-13]。目前報告的XLN病例，其突變位點均位于WASP的GBD結構域，WASP自身抑制平衡被打破，造成Arp2/3復合體持續(xù)激活，導致肌動蛋白聚合異常，細胞極化異常，細胞凋亡增加，這在一定程度上解釋了骨髓粒系成熟障礙[1-3, 14]。

XLN患者臨床表現(xiàn)為ANC減少，部分患者有反復細菌感染，但與重型先天性中性粒細胞減少癥(SCN)及經(jīng)典WAS綜合征患者相比，XLN患者感染相對較輕，導致了臨床上容易漏診及確診年齡較晚[2]。研究報道，XLN患者唾液的中性粒細胞數(shù)量正常，XLN小鼠模型實驗發(fā)現(xiàn)，由WAS功能獲得性突變導致中性粒細胞過度激活，并向外周組織遷移增加[15]。這是否可以解釋XLN患者雖然ANC數(shù)量低但感染并不嚴重的現(xiàn)象，有待進一步研究。

目前報道中對XLN患者的治療主要參照SCN治療方案，包括預防性應用抗生素和皮下注射G-CSF。G-CSF是快速升高ANC的最有效方法，可以明顯改善患者預后和生存質量[16]，但是長期使用存在并發(fā)血液系統(tǒng)惡變的風險，以急性髓細胞白血病(AML)和骨髓增生異常綜合征(MDS)最為常見。國際重癥慢性中性粒細胞減少癥登記處(SCNIR)對長期大劑量使用G-CSF治療SCN患者隨訪15年后發(fā)現(xiàn)，約22%轉化為AML/MDS[17]。SCN患者長期使用G-CSF可造成CSF3R基因繼發(fā)突變，該基因突變與血液系統(tǒng)惡變高度相關，在XLN病例中同樣存在該現(xiàn)象[18]。2001年首次報道XLN家系的課題組[1]對該家系中5例患者長期隨訪，于2009年發(fā)現(xiàn)2例患者發(fā)生血液系統(tǒng)惡變[18]，其中1例患者33歲起使用G-CSF 0.3 mg，每周3次，6年后發(fā)生AML，同時發(fā)現(xiàn)CSF3R基因g.2425T>G(p.Y729)突變；另1例患者63歲開始使用G-CSF 0.3 mg·d-1，持續(xù)皮下注射2年后發(fā)生MDS-RAEB，并發(fā)現(xiàn)CSF3R基因g.2390C>T (p.Q718)突變造成的CSF3R翻譯提前終止。鑒于嬰兒期因粒細胞減少導致膿毒血癥而夭折的風險較大，而長期使用G-CSF又有引起CSF3R繼發(fā)突變和導致血液系統(tǒng)惡變的風險，因而有研究者建議預防性使用抗生素作為基本治療手段，并在綜合考慮風險與收益的基礎上，建議嬰兒期使用G-CSF[3]?？傊瑢κ欠袷褂肎-CSF，仍有爭議，目前尚無對G-CSF治療無反應或行骨髓移植治療的XLN病例報道。

本例患兒是國內報道的第1例因WAS基因功能獲得性突變導致XLN的病例，外周血ANC持續(xù)減少、骨髓粒細胞成熟障礙是重要的臨床診斷線索，基因檢測發(fā)現(xiàn)WAS基因突變可以明確診斷。與經(jīng)典WAS綜合征引起WASP表達缺失或低表達不同，XLN患者的WASP仍可表達，也是臨床上容易忽視的重要因素。因此，對臨床上懷疑先天性粒細胞減少癥的患兒，需警惕WAS基因缺陷。