魏 利，李桂秋

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科，哈爾濱 150001)

金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，SA)是一種重要的人類病原體，在19世紀(jì)80年代就已經(jīng)被認(rèn)為是化膿性膿腫的病因[1]。SA感染的范圍從輕微的皮膚和軟組織感染到威脅生命的心內(nèi)膜炎、慢性骨髓炎、肺炎或菌血癥，這些感染性疾病的發(fā)病率和病死率均較高[2]。在20世紀(jì)中期，抗生素如青霉素和甲氧西林的出現(xiàn)和使用，最初被證明對(duì)治療SA感染有效。然而，SA對(duì)這些抗生素迅速產(chǎn)生耐藥性，且耐青霉素金黃色葡萄球菌感染進(jìn)一步發(fā)展成為難治的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)。近年來(lái)，萬(wàn)古霉素雖然被認(rèn)為是治療嚴(yán)重MRSA感染的標(biāo)準(zhǔn)方法，但臨床上已分離出SA對(duì)萬(wàn)古霉素敏感性降低的中介耐藥株[3]，主要是廣泛報(bào)道的異質(zhì)性萬(wàn)古霉素中介金黃色葡萄球菌[heteroresistant vancomycin-intermediate Staphylococcus aureus，hVISA，最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration,MIC)≤2 μg/mL]和萬(wàn)古霉素中介金黃色葡萄球菌(vancomycin-intermediate Staphylococcus aureus,VISA，MIC 4～8 μg/mL)，或是較少見(jiàn)的對(duì)萬(wàn)古霉素耐藥金黃色葡萄球菌(vancomycin-resistant Staphylococcus aureus,VRSA，MIC≥16 μg/mL)?，F(xiàn)對(duì)萬(wàn)古霉素在SA中耐藥性的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 流行病學(xué)

1997年，日本平松啓一教授團(tuán)隊(duì)首次發(fā)現(xiàn)一株對(duì)萬(wàn)古霉素的敏感性降低的SA[4]，該團(tuán)隊(duì)從1例接受心臟手術(shù)后胸骨切口發(fā)生化膿性感染患者的分泌物中分離培養(yǎng)出了MRSA，給予該患者萬(wàn)古霉素聯(lián)合氨芐西林/舒巴坦和阿貝卡星治療后痊愈。隨后，許多國(guó)家開(kāi)始篩選VISA/hVISA。Song等[5]使用瓊脂平板篩選法篩選分離了來(lái)自12個(gè)亞洲國(guó)家的1 349株MRSA，58株確認(rèn)為是hVISA，發(fā)生率為4.3%；Lewis等[6]報(bào)道在2005—2007年英國(guó)血流感染的195例SA標(biāo)本中檢測(cè)出hVISA發(fā)生率約為18.0%；Sun等[7]收集了來(lái)自14個(gè)城市的MRSA，在1 012株MRSA中hVISA的發(fā)生率為13%～16%。不同國(guó)家和地區(qū)分離培養(yǎng)出VISA/hVISA菌株數(shù)不同，如Mynarczyk等[8]從來(lái)自波蘭的103株SA菌株中分離VISA/hVISA，分離率為4.8%；Garnier等[9]收集法國(guó)2 300株SA菌株，其中VISA/hVISA的分離率為11.1%；Rybak等[10]對(duì)美國(guó)的356株SA菌株分離VISA/hVISA，分離率為7.6%；Casapao等[11]對(duì)美國(guó)的66株SA菌株分離VISA/hVISA，分離率為18.8%。各國(guó)家或地區(qū)的分離率不同，這些差異的主要原因可能是不同患者、不同地域和不同的檢測(cè)方法造成的。

2 VRSA和VISA的分子機(jī)制

2.1VRSA的分子機(jī)制 VRSA(MIC≥16 μg/mL)由轉(zhuǎn)座子Tn1546編碼的VanA操縱子編碼，通過(guò)保留原始的腸球菌質(zhì)?；蛲ㄟ^(guò)將萬(wàn)古霉素耐藥腸球菌質(zhì)粒中的Tn1546轉(zhuǎn)換成葡萄球菌常駐質(zhì)粒而發(fā)揮耐藥作用[12]。

細(xì)菌細(xì)胞壁的主要成分是交聯(lián)的肽聚糖，肽聚糖主要由通過(guò)甘氨酸橋和五肽(UDP-MurNAc-L-Ala-D-iso-Gln-L-Lys-D-Ala-D-Ala)彼此交聯(lián)的聚糖鏈N-乙酰葡糖胺和N-乙酰胞壁酸組成。在革蘭陽(yáng)性菌中，萬(wàn)古霉素通過(guò)與新合成的UDP-MurNAc-五肽的倒數(shù)第2個(gè)D-Ala-D-Ala殘基形成非共價(jià)氫鍵，抑制后期肽聚糖的合成，從而破壞下游肽聚糖組裝。所以，當(dāng)給予萬(wàn)古霉素治療SA感染后，萬(wàn)古霉素-五肽復(fù)合物可在細(xì)胞內(nèi)形成,進(jìn)而抑制細(xì)胞壁的合成，殺死細(xì)菌[13]。

VanA操縱子介導(dǎo)的萬(wàn)古霉素耐藥主要通過(guò)兩個(gè)重要步驟：①水解與萬(wàn)古霉素結(jié)合的二肽D-Ala-D-Ala肽聚糖前體；②不能結(jié)合萬(wàn)古霉素的D-Ala-D-Lac肽聚糖前體的合成[14]。VanA操縱子由VanA、VanH、VanX、VanS、VanR、VanY和VanZ基因組成。VanA操縱子是通過(guò)由VanS和VanR編碼的雙重傳感器-調(diào)節(jié)子系統(tǒng)控制的，分別識(shí)別萬(wàn)古霉素并激活操縱子的轉(zhuǎn)錄[15]。VanA、VanH和VanX是萬(wàn)古霉素抗性表型必不可少的部分，其中，VanA和VanH負(fù)責(zé)合成縮肽D-Ala-D-Lac；VanA是催化D-Ala-D-Lac縮酚酸酯酯鍵形成的連接酶；VanH是通過(guò)還原丙酮酸鹽形成D-Lac的脫氫酶[16]；VanX是D，D-二肽酶，水解D-Ala-D-Ala酯鍵，確保減少新形成的D-Ala-D-Lac縮酚酸肽與結(jié)合UDP三聯(lián)肽聚糖前體的競(jìng)爭(zhēng)。VanY是一種D,D-羧基肽酶，通過(guò)促進(jìn)已經(jīng)附著在莖五肽結(jié)構(gòu)末端的D-Ala-D-Ala二肽的裂解來(lái)執(zhí)行類似的功能，但不是必需功能[17]。VanZ的作用尚不清楚，但它可能與SA對(duì)替考拉寧的耐藥性有關(guān)。

2.2VISA的分子機(jī)制 VISA通常與持續(xù)感染、萬(wàn)古霉素治療時(shí)間延長(zhǎng)等有關(guān)。hVISA表型是指親代SA對(duì)萬(wàn)古霉素敏感(MIC≤2 μg/mL)，而子代SA可以含有少量能在萬(wàn)古霉素≥4 μg/mL培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的耐藥亞群[18]。盡管近年來(lái)對(duì)hVISA的研究取得了一定的進(jìn)展，但hVISA發(fā)展的分子機(jī)制尚未完全確定。如Roch等[19]證明，SA暴露于非糖肽類抗生素如β內(nèi)酰胺類可能會(huì)引發(fā)hVISA表型。Haaber等[20]報(bào)道USA300菌株暴露于黏菌素，增強(qiáng)了萬(wàn)古霉素的耐藥性，證明這種現(xiàn)象是在基因表達(dá)水平上進(jìn)行調(diào)節(jié)，因此是可逆的。上述研究為hVISA的發(fā)展是表觀遺傳學(xué)過(guò)程提供了證據(jù)。

目前普遍認(rèn)為VISA對(duì)萬(wàn)古霉素具有均一的耐藥性，VISA是由長(zhǎng)期使用糖肽類抗生素治療的hVISA發(fā)展而來(lái)[19-20]。VISA表型的基本特征包括由差異調(diào)節(jié)的細(xì)胞壁生物合成和刺激途徑引起的細(xì)胞壁厚度增加，肽聚糖的交聯(lián)減少，與細(xì)胞壁更新相關(guān)酶的自溶活性降低，表面蛋白質(zhì)譜改變，輔助基因調(diào)節(jié)因子(agr)系統(tǒng)的功能障礙和生長(zhǎng)特性變化[21]。近年來(lái)，已形成多種研究VISA表型的分子遺傳基礎(chǔ)的方法。Katayama等[22]通過(guò)向萬(wàn)古霉素敏感金黃色葡萄球菌(vancomycin susceptible S. aureus，VSSA)毒株N315的6個(gè)不同基因中引入序列突變來(lái)產(chǎn)生實(shí)驗(yàn)室衍生的VISA毒株，研究發(fā)現(xiàn)VSSA菌株最有可能逐步發(fā)展成萬(wàn)古霉素中介菌株，通過(guò)獲得突變且每個(gè)突變都可以降低萬(wàn)古霉素的易感性。

VISA耐藥的分子機(jī)制尚不明確，但是編碼雙重調(diào)節(jié)系統(tǒng)的基因突變(如與糖肽抗性相關(guān)的graRS和walKR對(duì)VISA的耐藥性)至關(guān)重要。DNA依賴性的RNA聚合酶β亞基的基因編碼能夠通過(guò)增加細(xì)胞壁的厚度增加對(duì)萬(wàn)古霉素的耐藥性[23]。graRS差異調(diào)節(jié)細(xì)胞壁生物合成基因的轉(zhuǎn)錄，與在VISA表型中起作用的基因和調(diào)節(jié)子有關(guān)[24]。graRS上調(diào)生物膜合成操縱子中的基因，導(dǎo)致生物膜生產(chǎn)增加。兩項(xiàng)獨(dú)立研究發(fā)現(xiàn)，graRS中的點(diǎn)突變降低了對(duì)萬(wàn)古霉素的易感性，此外，graRS上調(diào)dlt操縱子和mprF/fmtC基因，與磷壁酸丙氨?；图?xì)胞壁電荷的改變有關(guān)[23-24]。graRS突變與全球調(diào)節(jié)因子阻遏毒素(rot)和agr的修飾表達(dá)有關(guān)[19,23]。在hVISA和VISA菌株中，agr功能降低，有利于萬(wàn)古霉素耐藥性的發(fā)展，并有可能促進(jìn)生物膜的生成，最終增加hVISA的存活率[25]。VISA分離株在vraSR基因中具有非沉默突變,這種突變可能導(dǎo)致下游超過(guò)40個(gè)細(xì)胞壁合成基因的上調(diào)，包括產(chǎn)生細(xì)胞壁衍生物如D-Ala-D-Ala)所需的基因[26]。walKR是與VISA表型相關(guān)的另一種雙組分基因調(diào)控系統(tǒng)，通過(guò)獲得的突變或插入IS256下調(diào)walKR操縱子導(dǎo)致多糖合成增加，細(xì)胞壁厚度增加，自溶減少[18,24]。另外，與VSSA菌株相比，VISA菌株可能通過(guò)使醋酸鹽的分解代謝下降，從而導(dǎo)致細(xì)菌的生長(zhǎng)特性發(fā)生改變、細(xì)胞死亡改變，抗生素耐受性以及細(xì)胞間黏附的多糖合成增加[27]。產(chǎn)生萬(wàn)古霉素中介表型的上述遺傳修飾可以在不同分離株之間有顯著差異，某些突變通常與特定的SA譜系有關(guān)。盡管如此，Vidaillac等[28]證明親本遺傳背景不一定能導(dǎo)致VISA表型的突變，而來(lái)源于相同親本分離株的平行分離株可以在各種環(huán)境壓力下獲得不同突變。Berscheid等[29]證明，VSSA菌株在體外的序列突變可產(chǎn)生萬(wàn)古霉素MIC≥32 μg/mL的分離株，超過(guò)了VRSA的折點(diǎn)。這種機(jī)制與VanA型萬(wàn)古霉素抗性相反，萬(wàn)古霉素不能與修飾的D-Ala-D-Lac肽結(jié)合。hVISA/VISA分離株細(xì)胞壁更厚，肽聚糖交聯(lián)的減少和游離D-Ala-D-Ala殘基過(guò)量是在細(xì)胞壁內(nèi)作為萬(wàn)古霉素的靶標(biāo)；另外，結(jié)合D-Ala-D-Ala的萬(wàn)古霉素在細(xì)胞壁積累，從而阻礙萬(wàn)古霉素的進(jìn)一步擴(kuò)散[17,29]。然而，有研究表明[30]，萬(wàn)古霉素耐藥水平較高的VISA菌株較不穩(wěn)定，往往恢復(fù)到與hVISA或萬(wàn)古霉素耐藥性的較低水平。

3 臨床分類和治療

臨床上感染hVISA/VISA患者越來(lái)越普遍，感染后會(huì)引起萬(wàn)古霉素治療的失敗。影響VISA和hVISA的臨床因素較多，其中一個(gè)重要因素是缺乏前瞻性對(duì)照研究。臨床上普遍認(rèn)為SA中低水平的萬(wàn)古霉素耐藥與萬(wàn)古霉素治療失敗和不良的臨床結(jié)果有關(guān)。為提高h(yuǎn)VISA/VISA檢出率，2006年，臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)將SA對(duì)萬(wàn)古霉素耐藥臨界值進(jìn)行了更新，規(guī)定VISA的MIC為4～8 μg/mL，MIC≤2 μg/mL為VSSA，MIC≥16 μg/mL為VRSA[31]。臨床研究普遍認(rèn)為，對(duì)于MIC>8 μg/mL的VISA感染，糖肽類抗生素的治療并不是最佳的[32]。另外，對(duì)于深部膿腫、骨髓炎和心內(nèi)膜炎等有大量hVISA感染，可考慮手術(shù)治療[32]。

達(dá)托霉素是hVISA和VISA感染的替代治療選擇，有研究指出，在體外菌株的萬(wàn)古霉素高M(jìn)IC值與達(dá)托霉素的非敏感性之間具有相關(guān)性[33]。由于達(dá)托霉素的殺菌活性取決于使用濃度，故需要較高劑量達(dá)托霉素MIC治療心內(nèi)膜炎和以抗微生物穿透力差為特征的感染部位的hVISA和VISA感染[34]。體外研究觀察到在模擬心內(nèi)膜贅生物中用高劑量達(dá)托霉素[10 mg/(kg·d)持續(xù)8 d]和劑量遞減[10 mg/(kg·d)，持續(xù)4 d，接著6 mg/(kg·d)，持續(xù)4 d方案與標(biāo)準(zhǔn)方案6 mg/(kg·d)，持續(xù)8 d]和劑量遞增[6 mg/(kg·d)，持續(xù)4 d，然后10 mg/(kg·d)，持續(xù)4 d]，兩種方案相比,劑量遞減方案對(duì)hVISA毒株的殺傷作用顯著增加(P<0.024)[34]。以上達(dá)托霉素給藥方法可能導(dǎo)致體內(nèi)菌血癥更快治愈，并防止達(dá)托霉素不敏感的情況出現(xiàn)[34]。然而，尚未發(fā)表評(píng)估高劑量達(dá)托霉素給藥劑量和適當(dāng)持續(xù)時(shí)間的體內(nèi)研究。高劑量達(dá)托霉素單獨(dú)用于hVISA或VISA感染患者的作用尚不清楚。在有更多證據(jù)可供使用前，對(duì)于可能存在hVISA或VISA感染風(fēng)險(xiǎn)的患者(如高細(xì)菌負(fù)荷感染，萬(wàn)古霉素治療失敗)考慮使用達(dá)托霉素時(shí)需要謹(jǐn)慎。

Mdicines公司開(kāi)發(fā)的新型糖肽類抗菌藥物奧利萬(wàn)星，對(duì)包括耐萬(wàn)古霉素的葡萄球菌、腸球菌等革蘭陽(yáng)性菌具有良好抗菌活性，通過(guò)多重作用機(jī)制防止耐藥性產(chǎn)生，進(jìn)而減少耐藥形成[38]。

4 小 結(jié)