張 霽，吳麗潔，李志元，吳煥淦,，楊延婷,，李茜瑩，吳丹艷，智方圓，洪 玨，劉 婕，張 丹,＊＊，馬曉芃,＊＊

（1.上海中醫(yī)藥大學(xué) 上海 201203；2.上海市針灸經(jīng)絡(luò)研究所 上海 200030；3.浙江省中醫(yī)院 杭州 310006）

克羅恩?。–rohn's Disease，CD）是消化科常見(jiàn)疑難病，以結(jié)腸局灶性、非特異性的炎癥損傷和肉芽腫為主要病變特征，在世界范圍內(nèi)其發(fā)病率逐年升高[1，2]。CD患者反復(fù)經(jīng)歷腹痛、腹瀉、便血等癥狀，生活質(zhì)量降低，其腸外表現(xiàn)多樣，且并發(fā)癥多嚴(yán)重兇險(xiǎn)[3，4]。誘導(dǎo)并維持臨床緩解以及黏膜愈合，防治并發(fā)癥，改善患者生命質(zhì)量是國(guó)內(nèi)較為公認(rèn)的炎癥性腸病（包括克羅恩病和潰瘍性結(jié)腸炎）的治療目標(biāo)[5]。因此，防治早中期CD、促使臨床緩解、延緩疾病進(jìn)展具有十分重要的意義。

近年來(lái)，研究證實(shí)艾灸雙側(cè)天樞、氣海穴等對(duì)CD患者臨床癥狀、生活質(zhì)量有良好的改善作用[6；7]。艾灸具有促進(jìn)結(jié)腸血液循環(huán)、增強(qiáng)腸道蠕動(dòng)、修復(fù)結(jié)腸損傷黏膜、調(diào)節(jié)結(jié)腸免疫反應(yīng)、提高患者自愈率以及減少病變復(fù)發(fā)等作用，有療效溫和、治療感受度好等特點(diǎn)，尤其在改善結(jié)腸炎患者腹痛、腹瀉等各種癥狀方面有著較好的效果[8；9]。盡管艾灸治療CD的短期療效和長(zhǎng)期療效已被普遍認(rèn)可，但其作用機(jī)制依舊不十分明確。深入揭示艾灸治療CD的作用機(jī)制有助于促進(jìn)艾灸在CD治療中的應(yīng)用與推廣。慢性、非特異性、透壁性炎癥反應(yīng)是CD的根本病變，CD患者局部結(jié)腸存在大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和各種細(xì)胞因子的異常表達(dá)[5，10]。有研究證實(shí)，絲裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinase，MAPK）參與了CD結(jié)腸的炎癥反應(yīng)和組織損傷，該通路的靶向抑制有助于結(jié)腸炎的緩解[11，12]。艾灸對(duì)CD有較好的抗炎及促進(jìn)黏膜愈合的作用[13-15]，是否與MAPK信號(hào)通路調(diào)節(jié)有關(guān)？目前尚未見(jiàn)相關(guān)研究。因此，本課題采用三硝基苯磺酸（2，4，6 Trinitrobenzene-sulfonic acid，TNBS）合乙醇溶液灌腸建立CD大鼠模型，觀察艾灸對(duì)CD大鼠結(jié)腸單核細(xì)胞趨化因子1（Monocyte chemoattractant protein 1，MCP-1）、環(huán)氧合酶2（Cyclooxygenase 2，COX2）、c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）、核轉(zhuǎn)錄因子c-Jun的影響，從JNK信號(hào)通路調(diào)節(jié)角度，探討艾灸治療CD及其抗炎效應(yīng)的可能免疫學(xué)機(jī)制，為艾灸治療CD療效機(jī)制的闡明提供科學(xué)實(shí)驗(yàn)資料。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康雄性清潔級(jí)SD（S prague-Dawley）大鼠36只，體質(zhì)量（150±20）g，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，合格證號(hào)：SCXK（滬）2013-0016，飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。飼養(yǎng)條件：清潔級(jí)，8∶00-20∶00光照、20∶00-8∶00黑暗，溫度（20±1）℃，濕度50%左右，自由飲水、攝食。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，大鼠飲食、活動(dòng)正常后開始實(shí)驗(yàn)。SD大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、艾灸組和假灸組，每組9只。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑與儀器

5%TNBS（Sigma公司）；Trizol（Invitrogen公司）；DEPC水（基爾頓生物公司）；SYBR Green PCR試劑盒（Thermo公司）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Fermentas公司）；MCP-1、COX2、JNK、c-Jun ELISA檢測(cè)試劑盒（武漢基因美生物公司）；蘇木素染色液（南京建成生物公司）；伊紅染色液（南京建成生物公司）；戊巴比妥鈉（國(guó)藥集團(tuán)有限公司）；異丙醇、無(wú)水乙醇、氯仿、二甲苯、中性樹膠（國(guó)藥集團(tuán)有限公司）。

熒光顯微鏡及senscell分析軟件（Olympus公司）；PCR檢測(cè)儀（ABI公司）；酶標(biāo)儀（Labsystems Multiskan公司）；洗板機(jī)（Thermo Labsystems公司）；組織脫水機(jī)、包埋機(jī)、切片機(jī)、攤片機(jī)（Leica公司）。

1.3 CD模型制備

采用TNBS合乙醇溶液灌腸制備CD模型[16]。開始前大鼠禁食、不禁水24 h，將無(wú)水乙醇加雙蒸水配成50%乙醇，然后將TNBS與50%乙醇按照體積比2∶1混合成TNBS灌腸液；稱重后以生理鹽水配置的2%戊巴比妥鈉（30 mL?kg-1）行腹腔注射麻醉，造模大鼠以TNBS灌腸液3 mL?kg-1灌腸。具體操作：大鼠體位為頭下尾上，將灌腸針緩緩插入大鼠肛門6-8 cm，注入灌腸液，拔出灌腸針以后再將大鼠倒立1-2 min，以防灌腸液溢出。每7 d重復(fù)灌腸1次，共4次。造模結(jié)束后，每組隨機(jī)抽取1只大鼠，進(jìn)行結(jié)腸蘇木素-伊紅染色（Hematoxylin-eosin staining，HE），以確定模型制備是否成功。在確定模型制備成功的基礎(chǔ)上，開始干預(yù)治療。

1.4 分組與處理

艾灸組，采用隔藥灸治療，選取天樞（雙側(cè)）、氣海穴，每次每穴各灸2壯（約10 min），每日1次，共7次。藥餅主藥為附子粉，灸前用黃酒調(diào)和，并用動(dòng)物專用模具制成藥餅。用模具將艾絨壓實(shí)制成錐形艾炷，艾炷重量為90 mg，置于藥餅上，點(diǎn)燃艾炷施灸。假灸組取穴、藥餅、艾炷操作均同艾灸組，但不點(diǎn)燃艾炷，每次留置10 min，每日1次，共7次。模型組與正常組不進(jìn)行任何治療，只作與艾灸組相同的抓取與固定。

1.5 樣本處理

各組大鼠禁食、不禁水24 h，腹腔注射戊巴比妥鈉進(jìn)行麻醉。沿大鼠腹正中線剪開腹部皮膚，充分暴露直腸、結(jié)腸部分，自恥骨聯(lián)合處-盲腸取下結(jié)腸，沿腸系膜縱軸剖開，取自上而下的3 cm結(jié)腸組織，用4℃冷生理鹽水沖洗，分成3段，1段放入4%多聚甲醛溶液內(nèi)固定；2段放入凍存管置于液氮內(nèi)，后移入-80℃冰箱保存。

1.6 指標(biāo)檢測(cè)方法

1.6.1 結(jié)腸組織形態(tài)學(xué)觀察

采用HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察各組大鼠結(jié)腸組織形態(tài)學(xué)變化。主要步驟：結(jié)腸組織脫水、包埋、切片、烤片處理，二甲苯、梯度酒精中脫蠟脫水，蘇木素染色，1%鹽酸酒精分化，溫水返藍(lán)，0.5%伊紅染色，再依次經(jīng)梯度酒精至水，二甲苯透明，中性樹膠封片，光鏡下觀察并進(jìn)行結(jié)腸組織學(xué)評(píng)分。

表1 JNK、c-Jun mRNA實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物設(shè)計(jì)

1.6.2 結(jié)腸MCP-1、COX2、JNK、c-Jun蛋白濃度的檢測(cè)

采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（Enzyme Linked Immunoserbent Assay，ELISA）測(cè)定。按照ELISA檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書，按適當(dāng)比例稀釋待測(cè)樣本，于96孔板中依次加入待測(cè)樣本、親和素、酶標(biāo)試劑，充分混勻，37℃孵育。去除以上液體，再依次加入顯色劑A、顯色劑B，充分混合，37℃避光顯色。最后，加入終止液終止顯色反應(yīng)。酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)下測(cè)定OD值，蛋白含量與OD值之間呈正線性關(guān)系，通過(guò)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出標(biāo)本中目的蛋白的濃度。

1.6.3 結(jié)腸JNK、c-Jun的mRNA表達(dá)檢測(cè)

采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）檢測(cè)，主要步驟包括：①組織總RNA的抽提；②總RNA中DNA的消除：DNaseⅠ 1 μL；10×DNaseⅠBuffer 1 μL；總RNA≦1 ng；DEPC-H2O nμL。③逆轉(zhuǎn)錄cDNA：RNA-Primer Mix 12 μL；5×RT Reaction Buffer 5 μL；25 mM dNTPs 1 μL；25 U/μL RNase Inhibitor 1 μL；200 U/μL M-MLV Rtase 1 μL；Oligo(dt)181 μL；ddH2O(DNase-free)4 μL。PCR 擴(kuò)增：SYBR Green Mix 12.5 μL；Primer F 0.5 μL；Primer R 0.5 μL；ddH2O 9.5 μL；cDNA模板2 μL。④Real-time PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增條件：95℃，10 min(95℃，15 Sec；60℃，45 Sec)×40；95℃，15 Sec；60℃，1 min；95℃，15 Sec；60℃，15 Sec。記錄Ct值，以GAPDH作為內(nèi)參，通過(guò)2-△Ct法計(jì)算目的蛋白mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，對(duì)各組數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)分布和方差齊性檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布或近似正態(tài)分布的資料采用xˉ±s的形式表示；不符合正態(tài)分布的資料采用Median(Q25，Q75)的形式表示。若各組方差齊等，直接采用單因素方差分析（One-Way ANOVA）進(jìn)行檢驗(yàn)，如果檢驗(yàn)結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義則進(jìn)一步采用LSD檢驗(yàn)做兩兩比較。若各組方差不齊，采用非參數(shù)檢驗(yàn)。結(jié)果以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠結(jié)腸組織病理學(xué)觀察

光鏡下觀察，正常組大鼠結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)完整，黏膜上皮連續(xù)覆蓋，黏膜固有層單層杯狀細(xì)胞、腺腔排列整齊，黏膜下層為疏松結(jié)締組織，未見(jiàn)水腫或增生。模型組大鼠結(jié)腸損傷嚴(yán)重，主要表現(xiàn)為結(jié)腸局部黏膜上皮層缺失，裂隙性潰瘍形成，黏膜下結(jié)締組織明顯水腫伴大量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，黏膜下層可見(jiàn)成團(tuán)單核巨噬細(xì)胞聚集，局部杯狀細(xì)胞增生明顯，腺腔排列不規(guī)則；與正常組比較，模型組大鼠結(jié)腸組織病理學(xué)評(píng)分顯著增加（P＜0.01）。艾灸組大鼠結(jié)腸組織損傷明顯改善，表現(xiàn)為黏膜上皮層完整，大量杯狀細(xì)胞增生，單層杯狀細(xì)胞、腺腔排列尚整齊，黏膜下層結(jié)締組織輕度水腫，可見(jiàn)少量膠原纖維及淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)；與模型組、假灸組比較，艾灸組結(jié)腸組織病理學(xué)評(píng)分均降低（均P＜0.01，P＜0.05）。與模型組比較，假灸組大鼠結(jié)腸損傷無(wú)明顯減輕，評(píng)分差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（圖1，表2）。

2.2 結(jié)腸MCP-1、COX2蛋白濃度的檢測(cè)結(jié)果

與正常組比較，模型組大鼠結(jié)腸MCP-1、COX2蛋白濃度明顯增高（均P＜0.01）。與模型組比較，艾灸組大鼠結(jié)腸MCP-1、COX2蛋白濃度明顯降低（P＜0.01，P ＜ 0.05）；假灸組大鼠結(jié)腸MCP-1、COX2蛋白濃度無(wú)明顯變化（均P＞0.05）。與假灸組比較，艾灸組大鼠結(jié)腸MCP-1、COX2蛋白濃度顯著降低（P＜0.01，P ＜ 0.05）（表3）。

2.3 結(jié)腸JNK蛋白濃度及mRNA表達(dá)的檢測(cè)結(jié)果

與正常組比較，模型組大鼠結(jié)腸JNK蛋白濃度及mRNA表達(dá)均明顯增加（均P＜0.01）。與模型組比較，艾灸組大鼠結(jié)腸JNK蛋白濃度及mRNA表達(dá)均減低（均P＜0.01）；假灸組大鼠JNK蛋白濃度及mRNA表達(dá)無(wú)明顯變化（均P＞0.05）。與假灸組比較，艾灸組大鼠結(jié)腸JNK蛋白濃度及mRNA表達(dá)均顯著減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）（表4）。

2.4 結(jié)腸c-Jun蛋白濃度及mRNA表達(dá)的檢測(cè)結(jié)果

與正常組比較，模型組大鼠結(jié)腸c-Jun蛋白濃度及mRNA表達(dá)均無(wú)顯著變化（均P＞0.05）。與模型組比較，艾灸組、假灸組大鼠結(jié)腸c-Jun蛋白濃度及mRNA表達(dá)均無(wú)顯著變化（均P＞0.05）（表5）。

3 討論

盡管口服藥物或生物制劑的研發(fā)和應(yīng)用日趨成熟，但諸多報(bào)道顯示CD的靶向治療存在療效個(gè)體差異性和副反應(yīng)不明確等問(wèn)題，已有研究提出兩個(gè)以上藥物聯(lián)合的多靶點(diǎn)治療或有助于提高臨床療效，但結(jié)果尚待考證[17]。傳統(tǒng)針灸療法對(duì)機(jī)體的調(diào)節(jié)作用是多系統(tǒng)、多靶點(diǎn)的，能較好地發(fā)揮多向性治療效應(yīng)，在緩解CD患者臨床癥狀和促進(jìn)黏膜愈合同時(shí)，避免了一些不良反應(yīng)，是一種值得關(guān)注和推薦于臨床治療CD的有效手段。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，艾灸對(duì)CD大鼠結(jié)腸組織損傷和炎癥反應(yīng)有一定緩解作用，或與其對(duì)JNK信號(hào)通路調(diào)節(jié)有關(guān)，為艾灸治療IBD機(jī)制的闡明提供了科學(xué)實(shí)驗(yàn)資料和研究思路。

MAPK信號(hào)通路激活被證實(shí)與IBD結(jié)腸炎性損傷關(guān)系密切[11]。MAPK家族的信號(hào)通路一般主要包括胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶（Extracellular signal regulated kinase，ERK）、c-Jun氨基末端激酶/應(yīng)激激活蛋白激酶（JNK/SAPK）、p38MAPK、ERK5。JNK下游常見(jiàn)的轉(zhuǎn)錄因子有Jun家族（c-Jun、JunB、JunD）、ATF-2、c-Myc、NFAT家族、STAT家族，大部分轉(zhuǎn)錄因子磷酸化主要增加了轉(zhuǎn)錄活性，誘導(dǎo)基因表達(dá)[18]。已有研究發(fā)現(xiàn)，靶向抑制p38信號(hào)通路可以調(diào)節(jié)CD大鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞凋亡，促進(jìn)結(jié)腸損傷修復(fù)，但臨床研究并未有充分證據(jù)證實(shí)口服p38蛋白酶抑制劑在CD治療中的療效，其他家族激酶ERK、JNK、ERK5少有研究報(bào)道[19，20]。盡管存在爭(zhēng)議，但有12例的小樣本臨床觀察提示聯(lián)合抑制JNK和p38對(duì)CD病人疾病指數(shù)（CD Activity Index，CDAI）、結(jié)腸損傷有明顯緩解作用，提示靶向調(diào)節(jié)JNK可能是治療CD的有效機(jī)制[21]。本課題從JNK信號(hào)通路調(diào)控角度，研究艾灸治療CD、發(fā)揮抗炎效應(yīng)的作用機(jī)制，結(jié)果顯示艾灸下調(diào)了結(jié)腸JNK蛋白和mRNA的表達(dá)，降低結(jié)腸炎性蛋白MCP-1、COX2的含量，提示艾灸可能通過(guò)抑制結(jié)腸JNK信號(hào)通路進(jìn)而減少結(jié)腸MCP-1、COX2等炎性蛋白的含量發(fā)揮緩解腸道炎癥、促進(jìn)結(jié)腸損傷修復(fù)的作用，這與部分從ERK、NF-κB途徑研究的報(bào)道有所不同[15；22]。另外，我們的研究發(fā)現(xiàn)艾灸對(duì)結(jié)腸c-Jun蛋白和mRNA表達(dá)沒(méi)有調(diào)節(jié)作用，是否與本研究未檢測(cè)該蛋白的磷酸化活性、抑或是通過(guò)JNK通路其他下游轉(zhuǎn)錄因子的激活發(fā)揮作用，需待進(jìn)一步的研究以進(jìn)一步證實(shí)。

圖1 各組大鼠結(jié)腸組織HE染色結(jié)果（×200倍）

表2 各組大鼠結(jié)腸組織病理學(xué)評(píng)分的比較

表3 各組大鼠結(jié)腸MCP-1、COX2蛋白濃度的比較

表4 各組大鼠結(jié)腸JNK蛋白濃度及mRNA表達(dá)的比較

表5 各組大鼠結(jié)腸c-Jun蛋白濃度及mRNA表達(dá)的比較

研究發(fā)現(xiàn)，JNK的上游激活機(jī)制受到諸多因素影響，胞外白介素17（Interleukin 17，IL-17）、IL-1β、腫瘤壞死因子α（Tumor necrosis factor α，TNF-α）均可激活胞內(nèi)JNK上游激酶，使信號(hào)傳導(dǎo)至JNK，JNK再通過(guò)磷酸化一系列底物進(jìn)一步將信號(hào)傳遞至下游核轉(zhuǎn)錄因子，促進(jìn)IL-1β、TNF-α、誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶（Inducible nitric oxide synthase，iNOs）、前列腺素 E2（Prostaglandin E2，PGE2）等炎性因子表達(dá)[23]。盡管課題組前期研究工作提示，隔藥灸對(duì)CD大鼠結(jié)腸IL-17、IL-1β、TNF-α（JNK上游激活信號(hào)）有良好調(diào)節(jié)作用，參與了緩解炎癥、促進(jìn)結(jié)腸損傷愈合，但依舊缺少與之相關(guān)的信號(hào)通路級(jí)聯(lián)激活的系統(tǒng)研究[24-26]。因此，本研究深入觀察了這些胞外激活信號(hào)下游的JNK信號(hào)通路，從調(diào)節(jié)JNK信號(hào)通路角度闡釋艾灸治療CD的抗炎機(jī)制。由于艾灸對(duì)機(jī)體的調(diào)節(jié)作用是多靶點(diǎn)、多角度的，因此今后尚需進(jìn)一步從ERK、p38MAPK通路角度開展艾灸治療克羅恩病機(jī)制研究，以期系統(tǒng)全面地揭示艾灸對(duì)克羅恩病MAPK信號(hào)通路的調(diào)控機(jī)制。