李慧 馬玉環(huán) 王圣杰 許麗梅 許云騰 曾建偉 王麗麗 李西海 葉蕻芝

【摘 要】目的：探討?yīng)毣罴纳鷾种蒲装Y介導(dǎo)軟骨細(xì)胞基質(zhì)降解的機(jī)制。方法：取4周齡SD大鼠10只，采用機(jī)械-Ⅱ型膠原酶消化法建立軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng)體系。在光學(xué)顯微鏡下觀察軟骨細(xì)胞形態(tài)，用Ⅱ型膠原免疫組化鑒定軟骨細(xì)胞。將第2代軟骨細(xì)胞隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型對(duì)照組、中藥組，3組均連續(xù)干預(yù)培養(yǎng)8 h。采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測(cè)干預(yù)后各組軟骨細(xì)胞培養(yǎng)液中白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）含量。采用Western blot檢測(cè)干預(yù)后各組軟骨細(xì)胞中蛋白多糖1（PGS1）、基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）-13、MMP-9、MMP-3、蛋白聚糖酶（ADAMTS）-4、ADAMTS-5蛋白表達(dá)量。結(jié)果：①軟骨細(xì)胞免疫組化鑒定：第2代軟骨細(xì)胞胞漿呈棕黃色，細(xì)胞核不著色，具備軟骨細(xì)胞的典型特征。②ELISA檢測(cè)結(jié)果：與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組IL-1β、TNF-α含量明顯升高（P < 0.05）;與模型對(duì)照組比較，中藥組IL-1β、TNF-α含量均明顯下降（P < 0.05）。③Western blot法檢測(cè)結(jié)果：與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組PGS1蛋白表達(dá)量明顯降低（P < 0.01），MMP-13、MMP-9、MMP-3、ADAMTS-4、ADAMTS-5蛋白表達(dá)量均明顯升高（P < 0.01或P < 0.05）;與模型對(duì)照組比較，中藥組PGS1蛋白表達(dá)量明顯升高（P < 0.05），MMP-13、MMP-9、MMP-3、ADAMTS-4、ADAMTS-5蛋白表達(dá)量均明顯降低（P < 0.05）。結(jié)論：獨(dú)活寄生湯可以通過(guò)調(diào)控IL-1β、TNF-α、PGS1、MMP-13、MMP-9、MMP-3、ADAMTS-4、ADAMTS-5表達(dá)，明顯抑制脂多糖介導(dǎo)軟骨細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，改善軟骨細(xì)胞基質(zhì)穩(wěn)態(tài)失衡，從而延緩軟骨退變。

【關(guān)鍵詞】 骨關(guān)節(jié)炎;獨(dú)活寄生湯;軟骨細(xì)胞;炎癥因子;軟骨基質(zhì);大鼠

Study on the Mechanism of Duhuo Jisheng Tang（獨(dú)活寄生湯）Inhibiting Inflammation Mediated Matrix Degradation of Chondrocytes

LI Hui，MA Yu-huan，WANG Sheng-jie，XU Li-mei，XU Yun-teng，ZENG Jian-wei，WANG Li-li，LI Xi-hai，YE Hong-zhi

【ABSTRACT】Objective：To explore the mechanism of Duhuo Jisheng Tang（獨(dú)活寄生湯）inhibiting inflammation mediated matrix degradation of chondrocytes.Methods：Ten four-week-old SD rats were chosen to establish the chond-

rocyte culture system in vitro by mechanical-Ⅱcollagenase digestion method.The morpho-

logy of chondrocytes was observed under the optical microscope，and chondrocytes were identified by type-Ⅱcollagen immuno-

histochemistry.The generation-Ⅱ chond-

rocytes were randomly divided into three groups：the blank control group，the model control group and the Chinese medicine group.ELISA was used to detect the contents of IL-1β and TNF-α in the chondrocyte culture medium of each group.Western blot was used to detect the protein expressions of PGS1，MMP-13，MMP-9，MMP-3，ADAMTS-4 and ADAMTS-5 in chondrocytes.Results：①I(mǎi)mmunohistochemical identification of chondrocytes showed that the cytoplasm of the generation-II chondrocytes was brownish yellow and the nucleus was not stained，having typical characteristics of chondrocytes.②ELISA results showed that compared with the blank control group，the contents of IL-1β and TNF-α in the model control group increased significantly（P < 0.05）;compared with the model control group，the contents of IL-1β and TNF-α in the Chinese medicine group decreased significantly（P < 0.05）.③Western blot results showed that compared with the blank control group，the protein expression of PGS1 in the model control group decreased significantly（P < 0.01），and the protein expressions of MMP-13，MMP-9，MMP-3，ADAMTS-4 and ADAMTS-5 increased significantly（P < 0.01 or P < 0.05）;compared with the model control group，the protein expression of PGS1 in the Chinese medicine group increased significantly（P < 0.05），and the protein expressions of MMP-13，MMP-9，MMP-3，ADAMTS-4 and ADAMTS-5 decreased significantly（P < 0.05）.Conclusion：Duhuo Jisheng Tang can obviously inhibit the inflammatory response of chondrocytes mediated by lipopolysaccharide，improve the matrix homeostasis of chondrocytes and delay the degeneration of cartilage by regulating the expressions of IL-1β，TNF-α，PGS1，MMP-13，MMP-9，MMP-3，ADAMTS-4 and ADAMTS-5.

【Keywords】 osteoarthritis;Duhuo Jisheng Tang（獨(dú)活寄生湯）;chondrocytes;inflammatory factors;cartilage?matrix;rats

骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是在力學(xué)和生物學(xué)的共同作用下，導(dǎo)致軟骨細(xì)胞、細(xì)胞基質(zhì)以及軟骨下骨三者合成與降解失衡為特征的一種長(zhǎng)期、慢性關(guān)節(jié)疾病[1-2]。軟骨退變是OA最主要的病理特征，軟骨細(xì)胞基質(zhì)合成與分解代謝失衡是誘發(fā)軟骨退變的關(guān)鍵原因之一[3]。為充分了解復(fù)方中各味中藥之間的協(xié)同效應(yīng)及配伍機(jī)制，根據(jù)中藥的作用特點(diǎn)，選用獨(dú)活、桑寄生、防風(fēng)、秦艽、細(xì)辛、肉桂等6味具有祛風(fēng)濕、止痹痛的中藥，探討?yīng)毣罴纳鷾种蒲装Y介導(dǎo)軟骨細(xì)胞基質(zhì)降解的作用機(jī)制[4]?；|(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）和蛋白聚糖酶（ADAMTS）是參與軟骨基質(zhì)破壞的主要蛋白酶家族，在驅(qū)動(dòng)軟骨退變的過(guò)程中起重要作用[5-6]。當(dāng)炎癥發(fā)生時(shí)，白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）及腫瘤壞死因子-α（TNF-α）參與軟骨基質(zhì)降解的過(guò)程，通過(guò)聯(lián)系多個(gè)信號(hào)通路，促進(jìn)MMP-13、MMP-9、

MMP-3、ADAMTS-4及ADAMTS-5表達(dá)，導(dǎo)致蛋白多糖1（PGS1）丟失，加劇OA病情[7-8]。本研究以炎癥介導(dǎo)軟骨細(xì)胞基質(zhì)降解為切入點(diǎn)，建立由脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的OA細(xì)胞模型，深入探討?yīng)毣罴纳鷾种蒲装Y反應(yīng)的作用機(jī)制。

1 材料與儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)4周齡SD雄性大鼠10只，購(gòu)于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)SCXK（滬）2012-0001。清潔級(jí)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物環(huán)境設(shè)施：福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，使用許可證號(hào)SYXK（閩）2009-0001。實(shí)驗(yàn)方案通過(guò)醫(yī)學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 根據(jù)獨(dú)活寄生湯復(fù)方配比（獨(dú)活、桑寄生、秦艽、防風(fēng)、肉桂、細(xì)辛比例為3∶2∶2∶2∶2∶2）稱取相應(yīng)質(zhì)量的藥材（均購(gòu)于福建中醫(yī)藥大學(xué)承創(chuàng)堂），加入相應(yīng)質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇回流提取2次，每次1.8 h，合并濾液，濃縮、干燥。精密稱取獨(dú)活寄生湯提取物500 mg放至15 mL離心管中，加入10 mL含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的胎牛血清（FBS）的培養(yǎng)基（DMEM），超聲10 min，0.22 μm無(wú)菌型微孔濾膜過(guò)濾，置于4 ℃冰箱保存。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑 羊抗兔（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）;FBS、雙抗、DMEM（美國(guó)Hyclone公司）;磷酸鹽緩沖液（PBS）、胰蛋白酶（美國(guó)Hyclone公司）;Ⅱ型膠原酶（美國(guó)Sigma公司）;DAB檢測(cè)試劑盒（北京博士德公司）;IL-1β酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)試劑盒、TNF-α酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)試劑盒（美國(guó)R&D公司）;RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（強(qiáng)）（碧云天公司）;PVDF膜（美國(guó)Millipore公司）;PGS1抗體（美國(guó)Sigma公司）;CollagenⅡ、MMP-3、MMP-13、MMP-9抗體（美國(guó)Abcam公司）;ADAMTS-4、ADAMTS-5抗體（美國(guó)Santa Cruz公司）;TBST、電泳液（北京普利萊公司）;轉(zhuǎn)膜液（Thermo Fisher Scientific）;顯影液（碧云天公司）。

1.4 實(shí)驗(yàn)儀器 光學(xué)顯微鏡（Olympus，日本TKO光學(xué)儀器株式會(huì)社）;低溫高速離心機(jī)（64R型，美國(guó)BECKMAN公司）;全自動(dòng)酶標(biāo)儀（BIO-TEKELX80O型，美國(guó)Bio-Tek公司）;化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad公司）。

2 方 法

2.1 軟骨細(xì)胞分離、培養(yǎng)及鑒定 取4周齡清潔級(jí)SD雄性大鼠10只，脫頸椎處死;用手術(shù)剪刀截取膝關(guān)節(jié)，無(wú)菌條件下分離膝關(guān)節(jié)，切取表面軟骨，PBS漂洗3次;用刀片將軟骨切碎約1 mm3大小，置于含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%的Ⅱ型膠原酶培養(yǎng)皿中消化，每隔2 h吸取一次上清液;放入離心機(jī)以1000 r·min-1離心5 min，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的FBS DMEM培養(yǎng)液，輕輕吹打至細(xì)胞懸浮，接種于培養(yǎng)瓶中，放入CO2培養(yǎng)箱原代培養(yǎng)，重復(fù)4次。細(xì)胞長(zhǎng)滿至培養(yǎng)瓶底80%～90%時(shí)，傳第1代軟骨細(xì)胞;繼續(xù)培養(yǎng)并傳代，獲得第2代軟骨細(xì)胞。取第2代生長(zhǎng)良好的軟骨細(xì)胞接種于含有細(xì)胞爬片的6孔板中，加入2 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的FBS DMEM培養(yǎng)液;培養(yǎng)48 h后，PBS洗3次，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的多聚甲醛固定30 min;體積分?jǐn)?shù)為0.5%的曲拉通X-100破膜處理15 min，PBS洗3次;質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的H2O2處理10 min，蒸餾水洗3次;質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的BSA封閉1 h;陽(yáng)性組滴加兔抗CollagenⅡ（一抗，1∶200）孵育，陰性對(duì)照組用PBS代替，4 ℃過(guò)夜，PBS洗3次;加入山羊抗IgG（二抗，1∶1000）室溫孵育30 min，PBS洗3次，DAB顯色10 min后自來(lái)水漂洗，蘇木素復(fù)染，自來(lái)水漂洗、晾干、中性樹(shù)脂封片，光學(xué)顯微鏡下觀察軟骨細(xì)胞形態(tài)。

2.2 軟骨細(xì)胞分組 取第2代生長(zhǎng)良好的軟骨細(xì)胞按1×105個(gè)·mL-1接種于6孔板中，細(xì)胞貼壁后隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型對(duì)照組、中藥組，其中空白對(duì)照組以含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的FBS DMEM培養(yǎng);模型對(duì)照組以含濃度為10 ng·mL-1 LPS的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的FBS DMEM培養(yǎng);中藥組以含濃度為400 μg·mL-1獨(dú)活寄生湯和10 ng·mL-1LPS的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的FBS DMEM培養(yǎng)。3組均連續(xù)干預(yù)培養(yǎng)8 h。

2.3 ELISA法檢測(cè)軟骨細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-1β、TNF-α含量 干預(yù)8 h后，吸取各組軟骨細(xì)胞培養(yǎng)液，放入離心機(jī)以3000 r·min-1離心5 min，吸取上清液。按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)處理細(xì)胞培養(yǎng)液樣品，用多功能酶標(biāo)儀以450 nm波長(zhǎng)檢測(cè)樣品中IL-1β、TNF-α的含量。

2.4 Western blot法檢測(cè)軟骨細(xì)胞中PGS1、MMP-13、MMP-9、MMP-3、ADAMTS-4、ADAMTS-5蛋白表達(dá)水平 各組棄去培養(yǎng)液，PBS洗3次，加入200 μL蛋白裂解液（RAPI∶PMSF = 100∶1），置于4 ℃冰箱30 min后用細(xì)胞刮刀刮去裂解物，收集至EP管中。采用BCA法測(cè)定各組蛋白濃度，加入蛋白上樣緩沖液，加熱變性。根據(jù)定量結(jié)果，每孔上樣20 μg，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳分離，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，TBST洗滌;加入封閉液室溫孵育2 h，TBST洗滌;再分別加入PGS1、MMP-13、MMP-9、MMP-3、ADAMTS-4、ADAMTS-5、β-actin抗體，4 ℃孵育過(guò)夜;TBST洗膜3次，加入二抗，室溫孵育1 h，TBST洗膜3次;加入ECL顯影液曝光、顯影。應(yīng)用Image Lab圖像處理軟件對(duì)顯影后的蛋白條帶灰度值進(jìn)行分析。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以表示，3組軟骨細(xì)胞炎癥相關(guān)的基因和蛋白表達(dá)水平采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 軟骨細(xì)胞鑒定 第2代軟骨細(xì)胞胞漿被染為棕黃色，細(xì)胞核呈圓形不著色，具備軟骨細(xì)胞典型的生物學(xué)特征。見(jiàn)圖1。

3.2 3組軟骨細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-1β、TNF-α含量比較 干預(yù)后，與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組軟骨細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-1β、TNF-α含量明顯升高（P < 0.05）;與模型對(duì)照組比較，中藥組軟骨細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-1β、TNF-α含量均明顯下降（P < 0.05）。見(jiàn)表1。

3.3 3組軟骨細(xì)胞中PGS1、MMP-13、MMP-9、MMP-3、ADAMTS-4、ADAMTS-5蛋白表達(dá)水平比較 干預(yù)后，與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組軟骨細(xì)胞中PGS1蛋白表達(dá)量明顯降低（P < 0.01），而MMP-13、MMP-9、MMP-3、ADAMTS-4、ADAMTS-5 蛋白表達(dá)量均明顯升高（P < 0.01或P < 0.05）;與模型對(duì)照組比較，中藥組軟骨細(xì)胞中PGS1蛋白表達(dá)量均明顯升高（P < 0.05），而MMP-13、MMP-9、MMP-3、ADAMTS-4、ADAMTS-5蛋白表達(dá)量均明顯降低（P < 0.05）。見(jiàn)表2。

4 討 論

OA的核心病機(jī)為本痿標(biāo)痹，以肝腎虧虛為本，風(fēng)寒濕邪侵襲、痹阻筋絡(luò)為標(biāo)，故治療以補(bǔ)肝腎為主、祛濕寒為輔[9-10]。獨(dú)活寄生湯是臨床上治療OA的經(jīng)典方劑，它可以通過(guò)調(diào)控炎性細(xì)胞因子、促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖以及介導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡等過(guò)程獲得較好的結(jié)果，同時(shí)可以補(bǔ)肝益腎、祛除風(fēng)寒濕邪、止膝關(guān)節(jié)痹痛，標(biāo)本兼治，效果顯著。方中獨(dú)活具有祛深伏骨節(jié)之風(fēng)寒濕邪的作用;桑寄生補(bǔ)肝腎，壯筋骨，祛風(fēng)濕;防風(fēng)疏風(fēng)除濕，透邪外出;秦艽搜筋肉之風(fēng)濕，通經(jīng)止痛;細(xì)辛、肉桂辛散寒濕，溫通經(jīng)脈而止痛[11-13]。以上諸藥均具有祛風(fēng)止痛的功效。

炎癥在OA發(fā)展過(guò)程中起決定性作用[14-15]。IL-1β和TNF-α是參與關(guān)節(jié)軟骨破壞以及軟骨基質(zhì)降解最主要的炎癥因子[16]。IL-1β和TNF-α可以使關(guān)節(jié)軟骨合成一氧化氮，并促進(jìn)MMP-3的合成;MMP-3不僅可以降解細(xì)胞外基質(zhì)中PGS1、膠原等成分，而且可以激活MMP-9、MMP-13，進(jìn)而誘導(dǎo)ADAMTS-4、ADAMTS-5生成，加快關(guān)節(jié)軟骨的破壞[17-18]。ELISA結(jié)果顯示，獨(dú)活寄生湯可以降低由LPS誘導(dǎo)的炎癥軟骨細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-1β、TNF-α含量。Western blot結(jié)果顯示，獨(dú)活寄生湯可以促進(jìn)PGS1蛋白表達(dá)，抑制MMP-13、MMP-9、MMP-3、ADAMTS-4、ADAMTS-5蛋白表達(dá)。提示獨(dú)活寄生湯治療OA的作用機(jī)制可能是通過(guò)調(diào)控IL-1β和TNF-α表達(dá)水平，降低炎癥刺激，改善軟骨細(xì)胞內(nèi)微環(huán)境，保護(hù)關(guān)節(jié)軟骨。

本研究結(jié)果顯示，獨(dú)活寄生湯能夠降低LPS誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞炎癥反應(yīng)，維持軟骨基質(zhì)降解與合成平衡，延緩軟骨退變。但具體的作用靶點(diǎn)尚未清晰，之后我們應(yīng)對(duì)炎癥相關(guān)信號(hào)通路做進(jìn)一步探討，可以更加明確獨(dú)活寄生湯對(duì)OA的抑制作用。

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收稿日期：2019-06-06;修回日期：2019-07-25