吳葉丹，安昌善

延邊大學(xué)附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科 吉林延吉133000

近年來，靶向治療已使某些亞型的非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)受益，但由于繼發(fā)耐藥的產(chǎn)生，病死率仍很高。隨著腫瘤免疫治療的發(fā)展，免疫制劑PD1等正為肺癌患者帶來新的希望。Toll樣受體(toll-like receptors, TLRs)作為先天免疫中最重要的跨膜受體，參與誘導(dǎo)和調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)[1]。TLR3位于內(nèi)體膜中，其被激活可刺激癌細(xì)胞凋亡并觸發(fā)炎性細(xì)胞因子的分泌，目前可作為咽、乳腺、卵巢、頭頸、前列腺、口腔等部位癌癥的治療靶點(diǎn)[2-8]。PolyI∶C作為TLR3的配體，可激活TLR3、PKR、RIG-1和MDA5，直接誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡并破壞腫瘤微環(huán)境[9]。研究[10]證實(shí)，PolyI∶C單獨(dú)作用可誘導(dǎo)功能性TLR3蛋白低至中等水平表達(dá)的肺癌細(xì)胞的凋亡。本研究建立了小鼠NSCLC移植瘤模型，觀察PolyI∶C在小鼠體內(nèi)的抗腫瘤活性，報道如下。

1 材料與方法

1.1主要試劑和儀器DMEM、胎牛血清、青鏈霉素混合液、胰蛋白酶(含0.25%EDTA)、PBS均購于美國Hyclone公司，PolyI∶C復(fù)合物(Ltd 20171101，規(guī)格3 g/L)購于北京信福醫(yī)藥科技有限公司，PD1(BE-0033-2-25MG，規(guī)格7.83 g/L)購于美國BioXcell公司，TUNEL試劑盒購于德國Roche公司，Thermo 細(xì)胞培養(yǎng)箱購于Thermo Scientific公司，低速離心機(jī)購于北京白洋儀器有限公司，倒置顯微鏡購于日本 OlymPus 公司。

1.2實(shí)驗分組4～6周齡雌性C57BL/6小鼠，SPF級，體重16～18 g，購自北京維通利華實(shí)驗動物技術(shù)有限公司，實(shí)驗前均在動物房適應(yīng)1周，動物護(hù)理和所有實(shí)驗均經(jīng)北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所實(shí)驗動物倫理委員會批準(zhǔn)。小鼠NSCLC細(xì)胞株LL/2由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所提供，用胰蛋白酶消化，PBS洗滌2次以去除殘存的胰蛋白酶及含血清培養(yǎng)液，用PBS配制成終密度為5×106個/mL的單細(xì)胞懸液。將小鼠隨機(jī)分為4組，滴鼻組、肌注組、陰性對照組和PD1組，每組6只，利用LL/2細(xì)胞，依文獻(xiàn)[11]方法制備小鼠NSCLC移植瘤模型。每2天用游標(biāo)卡尺測量腫瘤直徑，計算腫瘤體積，腫瘤體積=腫瘤長徑×腫瘤短徑2×0.5。當(dāng)腫瘤體積達(dá)到100 mm3時，開始分組處理。滴鼻組每隔1天PolyI∶C滴鼻1次(0.3 mg/次)，肌注組每隔1天肌內(nèi)注射PolyI∶C 1次(0.3 mg/次)，PBS組每隔1天PBS滴鼻1次(100 μL/次)，PD1組腹腔注射以PBS稀釋為1 000 mg/L的PD1(100 μg/次，1周1次)。共用藥2周。

1.3觀察指標(biāo)

1.3.1 抑瘤率 給藥處理后每2天用游標(biāo)卡尺測量并計算腫瘤體積，繪制腫瘤生長曲線。每2天使用電子天平測量小鼠體重并繪制體重變化曲線。用藥2周后將小鼠脫頸處死，剝離腫瘤組織稱重，計算抑瘤率。抑瘤率=(腫瘤質(zhì)量PBS組-腫瘤質(zhì)量實(shí)驗組)/腫瘤質(zhì)量PBS組×100%。

1.3.2 移植瘤組織中細(xì)胞凋亡的檢測 移植瘤稱重后于甲醛溶液中固定，4 μm厚切片，用TUNEL凋亡試劑盒檢測，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。陽性細(xì)胞(即凋亡細(xì)胞)褐色著色。于200倍光學(xué)顯微鏡下選取5個代表性視野觀察并拍照，使用Image J軟件分析凋亡細(xì)胞百分比。

1.3.3 臟器轉(zhuǎn)移情況的觀察 處死小鼠時剝離肺、肝、腦等標(biāo)本，用甲醛固定，進(jìn)行HE染色，于40倍光學(xué)顯微鏡下選取5個代表性視野觀察，記錄各臟器轉(zhuǎn)移動物數(shù)。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理使用SPSS 19.0行數(shù)據(jù)分析。4組小鼠體重、移植瘤體積的比較采用重復(fù)測量數(shù)據(jù)的方差分析；抑瘤率的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1一般情況實(shí)驗期間各組小鼠均精神萎靡、活動減少、飲食較差，尤以PBS組表現(xiàn)最明顯，但無死亡。小鼠體重變化情況見表1。4組小鼠體重均逐漸增加，但從給藥第13天開始，肌注組小鼠體重增加幅度小于其他3組。

2.2 3組抑瘤率的比較移植瘤體積測定結(jié)果見表2。滴鼻組和肌注組移植瘤體積較PBS和PD1組減小(P<0.05)，而肌注組移植瘤體積較滴鼻組減小(P<0.05)。滴鼻組、肌注組和PD1組抑瘤率分別為(38.33±0.05)%、(50.39±0.03)%、(15.17±0.05)%，3組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=8.177,P=0.017);滴鼻組及肌注組抑瘤率較PD1組升高(P<0.05)，肌注組抑瘤率高于滴鼻組(P<0.05)。

表1 4組小鼠體重比較 g

F組間=30.576，F(xiàn)時間=54.698，F(xiàn)交互=8.659，P均<0.001

表2 4組移植瘤體積的比較 mm3

F組間=35.252，F(xiàn)時間=58.326,F交互=3.490，P均<0.001

2.3 4組移植瘤組織中細(xì)胞凋亡情況的比較PBS組、滴鼻組、肌注組及PD1組凋亡細(xì)胞百分比分別為(9.15±0.61)%、(12.33±0.61)%、(13.85±0.53)%和(11.39±1.02)%，4組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=30.119，P<0.001)；滴鼻組、肌注組及PD1組腫瘤細(xì)胞凋亡均增強(qiáng)(P<0.05)，且肌注組變化最為顯著。

2.4 4組各臟器轉(zhuǎn)移情況PBS組6只小鼠均發(fā)生肝、肺轉(zhuǎn)移；滴鼻組4只發(fā)生肝、肺轉(zhuǎn)移；PD1組發(fā)生肝轉(zhuǎn)移3只、肺轉(zhuǎn)移4只；肌注組6只小鼠均未發(fā)生臟器轉(zhuǎn)移。

3 討論

目前幾種TLR激動劑作為腫瘤疫苗或用于腫瘤的免疫治療而備受關(guān)注。PolyI∶C可被TLR3、RIG1、MDA5識別，誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子(如IRF3，IRF7和NF-kB等)的激活，促進(jìn)Ⅰ型IFN的釋放，促進(jìn)先天免疫的激活并長期促進(jìn)T細(xì)胞免疫，因此作為潛在的抗腫瘤制劑具有重要意義。研究[12]表明，肺組織中TLR3的激活可以升高局部IL-5、IL-13和IgE水平，這與肺部Th2樣病變高度相關(guān)。但有研究[13]結(jié)果顯示，對注射mKSA細(xì)胞的小鼠重復(fù)給予PolyI∶C和腫瘤特異性抗原SV40，可誘導(dǎo)移植瘤的消退。

本研究中，我們將LL/2細(xì)胞種植到小鼠體內(nèi)形成NSCLC移植瘤模型，觀察PolyI∶C單獨(dú)用藥的體內(nèi)抗腫瘤效果。結(jié)果顯示，與PBS組比較，滴鼻組和PD1組小鼠體重變化無統(tǒng)計學(xué)意義，肌注組小鼠體重增加幅度大大減小；滴鼻組和肌注組移植瘤體積較PBS和PD1組減小，抑瘤率高于PD1組，且肌注組抑瘤率高于滴鼻組。滴鼻組、肌注組及PD1組移植瘤中腫瘤細(xì)胞凋亡較PBS組增強(qiáng)，且肌注組變化最為顯著。PBS組6只小鼠均發(fā)生肝、肺轉(zhuǎn)移；滴鼻組4只發(fā)生肝、肺轉(zhuǎn)移；PD1組發(fā)生肝轉(zhuǎn)移3只、肺轉(zhuǎn)移4只；肌注組6只小鼠均未發(fā)生臟器轉(zhuǎn)移。上述結(jié)果提示，PolyI∶C復(fù)合物在小鼠體內(nèi)具有抗肺腫瘤活性，肌注給藥的效果好于滴鼻給藥，但副作用較大。

綜上所述，PolyI∶C復(fù)合物在小鼠體內(nèi)具有顯著的抗腫瘤、抗轉(zhuǎn)移作用，但是其體內(nèi)抗腫瘤作用的相關(guān)分子機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。