李 霞,徐智芳,麻 莉,門九章*

(1山西中醫(yī)藥大學(xué)第四臨床學(xué)院內(nèi)科教研室,晉中 030619;2山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院血液病分子診療山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;*通訊作者,E-mail:zydrmjz2005@163.com)

肝纖維化是各種慢性肝病向肝硬化發(fā)展的病理階段,也是機(jī)體對(duì)肝實(shí)質(zhì)損傷的一種修復(fù)反應(yīng)。肝纖維化的發(fā)生發(fā)展與機(jī)體免疫功能異常密切相關(guān),CD4+T淋巴細(xì)胞作為重要的免疫細(xì)胞在肝纖維化進(jìn)展中起重要作用[1]。其中,Th1細(xì)胞主要通過分泌干擾素-γ(interferon-γ,IFN-γ)和白細(xì)胞介素-2(interleukin-2,IL-2)等細(xì)胞因子發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用[2]。肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cells,HSC)活化是肝纖維化的中心環(huán)節(jié),抑制HSC活化是防治肝纖維化的重要途徑[3]。α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)是HSC活化的標(biāo)志。研究表明,IFN-γ通過抑制HSC增殖并下調(diào)HSC中α-SMA的表達(dá),發(fā)揮抗纖維化作用[4]。而IL-2在肝纖維化形成與逆轉(zhuǎn)中的作用尚未闡明,Th1細(xì)胞的作用仍存在爭議[5,6]。因此,本文旨在研究Th1細(xì)胞及其細(xì)胞因子IL-2在四氯化碳(carbon tetrachloride,CCl4)誘導(dǎo)大鼠肝纖維化進(jìn)展期與恢復(fù)期中的動(dòng)態(tài)變化,以及其與HSC活化的關(guān)系,探討Th1細(xì)胞及IL-2在肝纖維化發(fā)生發(fā)展及自發(fā)逆轉(zhuǎn)過程中的作用機(jī)制,為闡明肝纖維化的免疫機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

二甲基亞硝胺(DMN,批號(hào):14703781,上海惠城生物科技有限責(zé)任公司);大鼠白細(xì)胞介素-2(IL-2)ELISA檢測試劑盒(上海瓦蘭生物科技有限公司);兔抗鼠α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)抗體(英國Abcam公司);辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠免疫組化檢測試劑盒(上海瓦蘭生物科技有限公司);PE/Cy7標(biāo)記的CD4單克隆抗體、FITC標(biāo)記的IFN-γ單克隆抗體(美國Biolegend公司);紅細(xì)胞裂解液、細(xì)胞刺激劑和蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑復(fù)合物(美國eBioscience公司);Ficoll-Paque淋巴細(xì)胞分離液(美國GE公司);含HEPES的RPMI 1640培養(yǎng)基(美國Gibco公司);PBS(美國Sigma公司);Tanon 5200全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)(上海天能科技有限公司);iCEN-24R高速冷凍離心機(jī)(杭州奧盛儀器有限公司);RT-6100酶標(biāo)分析儀(美國雷杜公司);HI1210水浴鍋(德國leica公司);ROS-S26型UPW實(shí)驗(yàn)室超純水系統(tǒng)(武漢吉百瑞科技有限公司)。

1.2 肝纖維化模型建立與分組

SD大鼠80只,雄性,SPF級(jí),體質(zhì)量(200±20)g,購自中國食品藥品檢定研究院,合格證編號(hào)為SCXK(京)2014-0013,常規(guī)飼養(yǎng)1周后開始實(shí)驗(yàn)。80只SD大鼠隨機(jī)分成正常組40只和模型組40只,各組再分為4,8,12,16周4個(gè)亞組,每組10只。模型組大鼠均使用CCl4腹腔注射制備肝纖維化模型,腹腔注射50% CCl4橄欖油溶液(1 ml/kg),每周2次。正常組大鼠腹腔注射等量橄欖油。分別于注射CCl4的第4,8,12周末和停止注射CCl4后4周末(即注射CCl4第16周末)處死各組大鼠,收集血清和肝臟標(biāo)本待檢測。

1.3 指標(biāo)檢測及方法

1.3.1 肝組織病理學(xué)觀察 各組大鼠肝組織均以10%的甲醛固定,常規(guī)HE染色,觀察肝組織病理學(xué)改變。

1.3.2 血清IL-2水平檢測 采用ELISA法檢測大鼠血清IL-2水平,按試劑盒說明書進(jìn)行,在450 nm處測吸光度值,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算各待測血清IL-2水平。

1.3.3 免疫組化法檢測肝組織α-SMA蛋白表達(dá) 將石蠟切片用二甲苯脫蠟,梯度乙醇水化,浸入0.01 mol/L枸櫞酸鈉緩沖液(pH6.0)中高壓修復(fù)15 min,自然冷卻,0.02 mol/L PBS沖洗3次,每次3 min,置于3%H2O2中,濕盒孵育10 min,以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性。滴加一抗兔抗小鼠α-SMA抗體(1 ∶200),濕盒孵育,4 ℃孵育過夜。滴加二抗,濕盒孵育,室溫下放置30 min。DAB顯色,蘇木素復(fù)染3 min,置于二甲苯中透明2次,每次3 min,中性樹膠封片。每張肝組織切片隨機(jī)選取5個(gè)不連續(xù)視野拍照,使用Image-Pro Plus7.0圖像分析軟件對(duì)α-SMA的表達(dá)進(jìn)行半定量測定,計(jì)算平均光密度值。

1.3.4 流式細(xì)胞儀檢測脾臟Th1細(xì)胞比例 大鼠處死后無菌條件下取出脾臟,PBS清洗,在70 μm細(xì)胞濾網(wǎng)上研磨過濾,過濾后細(xì)胞與1.5 ml PBS混勻。在離心管中加入1.5 ml Ficoll-Paque淋巴細(xì)胞分離液,再加入PBS組織混合液,2 000 r/min離心20 min,離心后混合液分為四層,吸出第二層云霧層,PBS洗滌兩次后得到沉淀為淋巴細(xì)胞。取脾臟淋巴細(xì)胞懸液,加入紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞。用含HEPES的RPMI1640調(diào)整細(xì)胞濃度至1×106/ml,然后接種于24孔板,同時(shí)加入細(xì)胞刺激劑(PMA和離子霉素)和蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑(BFA和莫能菌素)復(fù)合物,置于37 ℃、5%CO2孵箱中刺激培養(yǎng)48 h。取出至流式試管中,加入2.5 μl PE/Cy7標(biāo)記的CD4抗體表面染色,4 ℃避光孵育30 min;加入2 ml PBS,1 500 r/min離心5 min,棄去上清液;漩渦振蕩重懸細(xì)胞后,加入0.5 ml固定/破膜工作液,漩渦振蕩后4 ℃避光孵育30 min;再加入1.5 ml破膜緩沖液(稀釋比例1 ∶9),孵育15 min后1 500 r/min離心5 min,棄去上清液;加入FITC標(biāo)記的IFN-γ抗體細(xì)胞內(nèi)染色,室溫避光孵育30 min,加入2 ml PBS 1 500 r/min離心5 min,棄去上清液;加入0.5 ml PBS重懸細(xì)胞后,將CD4+IFN-γ+細(xì)胞界定為Th1細(xì)胞,采用流式細(xì)胞儀檢測Th1細(xì)胞比例,結(jié)果采用FlowJo軟件進(jìn)行分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,計(jì)量資料數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,組間比較選用成組設(shè)計(jì)的t檢驗(yàn),多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析,相關(guān)性檢驗(yàn)采用Pearson相關(guān)分析,以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠肝組織病理學(xué)觀察結(jié)果

造模期間,模型組大鼠腹腔注射CCl4后死亡3只。正常組大鼠腹腔注射橄欖油第4,8,12周肝小葉結(jié)構(gòu)完整,可見清晰的中央靜脈、匯管區(qū)和肝索的結(jié)構(gòu),未見肝細(xì)胞水腫,未見纖維條索形成;第16周,即停止腹腔注射橄欖油第4周時(shí)肝索結(jié)構(gòu)正常,出現(xiàn)肝細(xì)胞水腫,但未發(fā)生氣球樣變。CCl4腹腔注射4周的模型組大鼠出現(xiàn)顯著的肝臟炎癥反應(yīng),肝細(xì)胞氣球樣變性,肝細(xì)胞壞死;8周的模型組大鼠正常肝小葉破壞,彌漫的肝細(xì)胞脂肪變性,橋接纖維化,炎細(xì)胞浸潤;12周的模型組大鼠纖維結(jié)締組織增生,假小葉形成;16周的模型組大鼠經(jīng)4周的恢復(fù),肝纖維化程度改善,纖維結(jié)締組織增生減少,纖維間隔變窄(見圖1)。

圖1 各組大鼠肝組織HE染色 (×400)Figure 1 HE staining of liver tissues of rats in each group (×400)

2.2 各組大鼠血清IL-2測定結(jié)果

與正常組同期比較,CCl4腹腔注射第4,8,12和16周模型組大鼠血清IL-2水平均顯著降低(P<0.01);模型組大鼠血清IL-2水平從第4周開始降低,之后隨造模時(shí)間延長逐漸下降,至第12周造模成功時(shí)血清IL-2水平最低,與第4周和8周比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001或=0.021),造模結(jié)束后第16周IL-2水平較第12周升高(P=0.045,見表1,圖2)。

表1 各組大鼠IL-2水平比較Table 1 Comparison of serum IL-2 level of rats at different time points between two

不同時(shí)間比較,F=8.338,P<0.001;與模型組12周比較,*P<0.05,**P<0.01圖2 模型組不同時(shí)間點(diǎn)大鼠血清IL-2水平Figure 2 Serum IL-2 of rats in model group at different time points

2.3 各組大鼠肝組織α-SMA蛋白表達(dá)結(jié)果

α-SMA免疫組化染色及平均光密度分析顯示,第4,8,12和16周正常組大鼠僅于小動(dòng)脈和小靜脈有少量α-SMA表達(dá)(見圖3)。與正常組同期比較,第4,8,12和16周模型組大鼠肝組織α-SMA表達(dá)量均顯著升高(P<0.01),4周模型組大鼠氣球樣變性的肝細(xì)胞可見α-SMA表達(dá);8周模型組大鼠在匯管區(qū)和纖維間隔處α-SMA呈陽性表達(dá);12周模型組大鼠在匯管區(qū)和纖維間隔可見大量α-SMA強(qiáng)陽性表達(dá),并擴(kuò)散到門靜脈區(qū)域,其表達(dá)量較第4周和第8周均明顯升高(均P<0.001);16周的模型組大鼠經(jīng)4周的恢復(fù),α-SMA表達(dá)量較第12周減少(P<0.001,見表2,圖4)。

圖3 免疫組化法檢測肝組織α-SMA蛋白表達(dá) (×400)Figure 3 The expression of α-SMA protein in liver tissues by immunohistochemistry (×400)

表2 各組大鼠肝組織α-SMA蛋白的表達(dá)Table 2 Expression of α-SMA in liver tissue of rats in each

2.4 各組大鼠脾臟Th1細(xì)胞比例測定結(jié)果

與正常組同期比較,CCl4腹腔注射第4,8,12和16周模型組大鼠脾臟Th1細(xì)胞比例均顯著降低(P<0.01);模型組大鼠脾臟Th1細(xì)胞比例從第4周開始降低,之后隨造模時(shí)間延長逐漸下降,至第12周造模成功時(shí)脾臟Th1細(xì)胞比例最低,與第4周和8周比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.001,0.017),造模結(jié)束后第16周脾臟Th1細(xì)胞比例較第12周升高(P=0.046,見表3,圖5,6)。

不同時(shí)間比較,F=44.794,P<0.001;與模型組12周比較,**P<0.01圖4 模型組不同時(shí)間點(diǎn)大鼠肝組織α-SMA表達(dá)結(jié)果Figure 4 Expression of α-SMA in liver tissue of rats in model group at different time points

表3 各組大鼠脾臟Th1細(xì)胞比例測定結(jié)果Table 3 Results of Th1 cell ratios of spleen of rats in each

2.5 各組大鼠肝組織α-SMA蛋白與Th1細(xì)胞及IL-2的相關(guān)性

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,模型組大鼠肝臟α-SMA蛋白與脾臟Th1細(xì)胞比例呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.575,P<0.01),α-SMA蛋白與外周血IL-2水平呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.608,P<0.01)。

不同時(shí)間比較,F=4.543,P<0.05;與模型組12周比較,*P<0.05,**P<0.01圖5 模型組不同時(shí)間大鼠脾臟Th1細(xì)胞比例Figure 5 The ratio of Th1 cells of spleen of rats in each model group

圖6 各組大鼠脾臟Th1細(xì)胞比例流式圖Figure 6 Th1 cell ratio in spleens of rats in each group by flow cytometry

3 討論

CCl4誘導(dǎo)肝纖維化模型是一種經(jīng)典的造模方法,其致病機(jī)制是CCl4被肝細(xì)胞攝取后,促進(jìn)大量自由基產(chǎn)生和脂質(zhì)過氧化損傷,導(dǎo)致肝細(xì)胞變性、壞死,肝功能破壞[7]。CCl4造模法能模擬人類肝纖維化的病理變化,而且停藥后有自愈傾向[8]。CCl4腹腔注射給藥可以制備不同分期肝纖維化模型[9],因此,本實(shí)驗(yàn)采用CCl4腹腔注射方法制備肝纖維化模型,并觀察其停止注射后4周的病理變化。結(jié)果表明,50%CCl4橄欖油溶液注射4周后,模型組大鼠出現(xiàn)顯著的肝臟炎癥反應(yīng),屬于肝損傷早期;8周后,形成橋接纖維化;12周后,形成了典型的肝纖維化病理改變。而停止CCl4腹腔注射后經(jīng)過4周的自然恢復(fù),模型組大鼠肝纖維化程度改善,纖維結(jié)締組織增生減少,屬于肝纖維化恢復(fù)期。

肝纖維化是一個(gè)涉及細(xì)胞、細(xì)胞因子、細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)等多個(gè)復(fù)雜因素的病理生理過程[10]。肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cells,HSC)是產(chǎn)生ECM的主要細(xì)胞,HSC轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞后合成與分泌Ⅰ型膠原等ECM成分,從而導(dǎo)致肝纖維化形成[11]。目前認(rèn)為,早期肝纖維化是可以逆轉(zhuǎn)的。實(shí)驗(yàn)性肝纖維化中去除肝損傷因素后,肝纖維化可逐漸逆轉(zhuǎn)[12],而肝纖維化恢復(fù)期的主要機(jī)制以HSC凋亡為主[13]。Th1細(xì)胞是CD4+T淋巴細(xì)胞中的一類亞群,主要分泌IFN-γ、IL-2等細(xì)胞因子。研究表明,IFN-γ可以通過下調(diào)熱休克蛋白70對(duì)HSC產(chǎn)生促凋亡作用,從而發(fā)揮抗纖維化作用[14]。目前已知外源性IL-2可以通過促進(jìn)肝臟調(diào)節(jié)性T細(xì)胞反應(yīng)而抑制肝纖維化[15],內(nèi)源性IL-2在肝纖維化形成與逆轉(zhuǎn)中的作用尚未闡明。而Th1細(xì)胞在肝纖維化形成中的作用仍然存在爭議。Gu等[16]采用腹膜內(nèi)注射20%CCl4橄欖油溶液制備小鼠肝纖維化模型,結(jié)果顯示肝纖維化小鼠脾臟Th1細(xì)胞比例較正常組明顯升高,提示Th1細(xì)胞在肝纖維化形成中起促進(jìn)作用。而Shi等[17]采用皮下注射50%CCl4橄欖油溶液制備大鼠肝纖維化模型,結(jié)果顯示肝纖維化大鼠Th1細(xì)胞比例較正常組明顯下降。這種差異可能與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及造模方法不同有關(guān)。因此,肝纖維化機(jī)制研究需要采用不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ秃头椒?以排除模型特異性的影響。本研究采用50%CCl4橄欖油溶液腹腔注射制備肝纖維化大鼠模型,結(jié)果顯示模型組大鼠脾臟Th1細(xì)胞比例與血清IL-2水平在CCl4注射后肝損傷早期即開始明顯下降,之后隨著CCl4注射時(shí)間的延長以及肝纖維化程度逐漸加重,Th1細(xì)胞比例與血清中IL-2水平持續(xù)下降,直至第12周末肝纖維化形成時(shí)降至最低。而模型組大鼠肝組織α-SMA蛋白表達(dá)從第4周開始持續(xù)升高,第12周最高。因?yàn)棣?SMA蛋白與脾臟Th1細(xì)胞比例及外周血IL-2水平呈顯著負(fù)相關(guān),提示在CCl4誘導(dǎo)大鼠肝纖維化進(jìn)展期,脾臟Th1細(xì)胞比例與外周血IL-2水平持續(xù)下降,對(duì)HSC活化的抑制作用減弱,從而導(dǎo)致肝纖維化的發(fā)生發(fā)展。本研究結(jié)果與Shi等[17]的結(jié)果一致,可能與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物種類及實(shí)驗(yàn)試劑濃度相同有關(guān)。此外,本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,大鼠肝纖維化恢復(fù)期α-SMA表達(dá)量較第12周明顯減少,而脾臟Th1細(xì)胞比例和血清IL-2水平明顯升高,肝纖維化程度明顯減輕,提示肝纖維化恢復(fù)期Th1細(xì)胞及其細(xì)胞因子IL-2升高,使活化的HSC減少,促進(jìn)肝纖維化逆轉(zhuǎn)。而IL-2是否可以促進(jìn)HSC凋亡,則需要體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。

綜上所述,本實(shí)驗(yàn)采用CCl4誘導(dǎo)大鼠肝纖維化,結(jié)果表明在肝纖維化進(jìn)展期與恢復(fù)期,Th1細(xì)胞、IL-2均與HSC活化密切相關(guān),通過對(duì)HSC活化的影響參與肝纖維化的發(fā)生發(fā)展及自發(fā)逆轉(zhuǎn)過程,為闡明肝纖維化的免疫機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。