孫梁琨 冉娜 胡琦蘭

[摘要]目的 探討替芬泰對HepG2 A64細胞基因水平表達的影響。方法 選取HepG2 A64耐藥細胞株作為研究對象，根據(jù)有無使用替芬泰將其分為觀察組與對照組，觀察組采用抗乙型肝炎病毒（HBV）效果較好的劑量122.5 μg替芬泰，對照組除不加替芬泰外，其余處理同觀察組。應(yīng)用基因芯片的方法，檢測并分析兩組HepG2 A64細胞中的基因表達水平。結(jié)果 實驗結(jié)果提示，觀察組細胞與對照組細胞比較，許多基因的表達出現(xiàn)相應(yīng)的上調(diào)或下調(diào)，編碼基因中表達差異10倍以上的基因有11個，分別為：ZNF503反義RNA 1（ZNF503-AS1）、絲氨酸肽酶抑制劑Kazal 4型（SPINK4）、白介素21受體（IL-21R）、鈣與整合素結(jié)合家族成員4（CIB4）、糖蛋白NMB（跨膜）（GPNMB）、CELF2反義RNA 2（CELF2-AS2）、酸性磷酸酶5（ACP5）、含有7B的kelch域（KLHDC7B）、突觸結(jié)合蛋白4（SYT4）、MRPL23反義RNA 1（MRPL23-AS1）、智人H19印跡母系表達的轉(zhuǎn)錄本（H19），其中IL-21R與免疫相關(guān);把差異表達倍數(shù)在1.5倍以上的基因取出，應(yīng)用KEGG通路分析，有9個，分別為：層粘連蛋白β3（LAMB3）、腫瘤壞死因子（TNF）、周期蛋白依賴性激酶抑制劑1A（p21）、B細胞慢性淋巴細胞白血病/淋巴瘤2（Bcl2）、周期蛋白依賴激酶6（CDK6）、轉(zhuǎn)錄激活因子4（CERB）、蛋白激酶C（PKC）、蛋白酪氨酸激酶2（Pyk2）、小鼠骨肉瘤病毒致癌基因同源（FOS），參與HBV感染相關(guān)分子調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)，從而通過干預(yù)胞內(nèi)信號通路鈣依賴性酪氨酸激酶-2（Calcium-Pyk2）傳導(dǎo)發(fā)揮體外抗HBV作用。結(jié)論 替芬泰可通過調(diào)控HBV復(fù)制下游Calcium-Pyk2信號通路和p21因子，從而對HBx蛋白的功能產(chǎn)生影響，達到抑制HBV復(fù)制的作用，并可通過影響細胞IL-21、Bcl2等免疫因子，提高細胞抗HBV作用。

[關(guān)鍵詞]替芬泰片;HepG2 A64細胞;基因水平;表達

[中圖分類號] R322.47 ? ? ? ? ?[文獻標識碼] A ? ? ? ? ?[文章編號] 1674-4721（2019）12（b）-0004-05

[Abstract] Objective To investigate the effect of Tifentail on gene expression in HepG2 A64 cells. Methods HepG2 A64 drug-resistant cell line was selected as the research object. In the observation group， 122.5 μg Tifentai （the dose with better anti-hepatitis B virus [HBV] effect） was used， and another blank control group was used. The control group was treated the same as the observation group except for the absence of Tifentail. Gene chip was used to detect and analyze gene expression in two groups of HepG2 A64 cells. Results The results showed that compared with the control group， the expression of many genes in the observation group was up-regulated or down-regulated， and there were eleven genes with the expression difference of more than 10 times in the coding genes， ZNF503 antisense RNA 1 （ZNF503-AS1）， serine peptidase inhibitor Kazal type 4 （SPINK4）， interleukin 21 receptor （IL-21R）， calcium and integrin binding family member 4 （CIB4）， glycoprotein （transmembrane） NMB （GPNMB）， CELF2 antisense RNA 2 （CELF2-AS2）， acid phosphatase 5 （ACP5）， kelch domain containing 7B （KLHDC7B）， synaptotagmin Ⅳ （SYT4）， MRPL23 antisense RNA 1 （MRPL23-AS1）， homo sapiens H19 imprinted maternally expressed transcript （H19） respectively. Among them， IL-21R was associated with immunity. The genes with differentially expressed multiples of 1.5 times or more were extracted and analyzed by KEGG pathway， laminin β3 （LAMB3）， tumor necrosis factor （TNF）， cyclin-dependent kinase inhibitor 1A （p21）， B-cell CLL/lymphoma 2 （Bcl2）， cyclin-dependent kinase 6 （CDK6）， activating transcription factor 4 （CERB）， protein kinase C γ （PKC）， protein tyrosine kinase 2 β （Pyk2）， murine osteosarcoma viral oncogene homolog （FOS） respectively. They were involved in the molecular regulatory network related to HBV infection， and thus play an anti-HBV role in vitro by interfering with intracellular signaling pathway calcium-dependent proline-rich tyrosine kinase-2 （Calcium-Pyk2） conduction. Conclusion Tifentail can inhibit HBV replication by regulating Calcium-Pyk2 signaling pathway and p21 factor downstream of HBV replication， and enhance the anti-HBV effect of cells by influencing immune factors such as IL-21 and Bcl2.

[Key words] Tefentail Tablets; HepG2 A64 cells; Gene level; Expression

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）是引起乙型肝炎（簡稱乙肝）的病原體[1]，全世界約有20多億人正在感染過或者感染過HBV，慢性乙型肝炎患者己超過4億人。我國的HBV感染率較高，全國感染過HBV的有50%～70%，其中慢性乙肝患者約有60%[2]。因此，降低HBV的感染率、加快對乙型肝炎的臨床治療和新藥研發(fā)已刻不容緩。近年來，我國的中草藥馬蹄金（貴州苗藥，旋花科，別名黃疽草，在廣西、四川又稱“小金錢草”）在治療乙型肝炎上得到了很好地利用，馬蹄金主治急、慢性肝炎、黃疽型肝炎、膽囊炎等癥[3]。而從馬蹄金中分離得到的替芬泰是具有抗乙肝病毒活性的單體馬蹄金素的衍生物，抗HBV的活性強[4]。

在替芬泰作用機制的研究初期，筆者對HBV復(fù)制環(huán)節(jié)的幾個關(guān)鍵靶點進行研究。通過研究發(fā)現(xiàn)，首先替芬泰對HBV聚合酶并沒有明顯的抑制活性，表明替芬泰的抗病毒機制不同于核苷（酸）類似物。其次，筆者從病毒復(fù)制環(huán)節(jié)并未找到替芬泰抑制HBV DNA的作用靶點，推測替芬泰可能誘導(dǎo)宿主免疫反應(yīng)達到抗病毒的作用，并且作用于病毒宿主相互作用的多個靶點。于是筆者從細胞整體水平進行研究，選用HepG2 A64耐藥細胞株作為研究對象，應(yīng)用基因芯片的方法，通過宿主自身的功能調(diào)節(jié)尋找其抗HBV的作用位點。本研究將考察替芬泰對HepG2 A64細胞基因水平表達的影響，旨在尋找替芬泰抗HBV的作用位點，為抗HBV藥品研發(fā)提供更多參考依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1對象與方法

1.1研究對象

HepG2A64細胞：拉米夫定和恩替卡韋都可產(chǎn)生耐藥的細胞系（突變位點：rtL180M+rtM204V+ rtT184L），由解放軍第302醫(yī)院肝衰竭中心構(gòu)建并進行傳代培養(yǎng)。

1.2主要儀器與試劑

1.2.1藥物 ?替芬泰，純度99%，由貴州省中國科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點實驗室合成，批號：20140106。

1.2.2試劑 ?DMEM培養(yǎng)液（美國Coring公司，批號：10-013-CVR）;胎牛血清（美國Gibco公司，批號：10099-141-500ML）;胰蛋白酶（Amresco公司，批號：Amresco-0785-1G）;EDTA（Amresco公司，批號：Amresco-177）;Trizol（美國ambion，批號：invitrogen 15596-026）;DMSO（Vetec公司，批號：V900090）;0.22 μm無菌濾器（sartorius stedim公司，批號：17575-K 25MM）。

1.2.3主要儀器 ?CCL-170B-8型二氧化碳培養(yǎng)箱（新加坡ESCO公司）;CKX53型倒置顯微鏡（日本Olympus公司）;CellBIND型細胞培養(yǎng)瓶（美國Coring公司）;COSTAR型6孔細胞培養(yǎng)板（美國Coring公司）;sorvall lynx 4000型低溫高速離心機（美國Thermo公司）;XB4200C型電子分析天平（上海天平儀器廠）;BSC-1800IIB2型生物安全柜（北京東聯(lián)哈爾）;DW-86W100J型超低溫冰箱（海爾集團）。

1.3實驗分組及處理

將采用122.5 μg（抗HBV效果較好的劑量）替芬泰的細胞作為觀察組，另設(shè)對照組，對照組除不加替芬泰外，其余處理同觀察組。

觀察組：將122.5 μg替芬泰分別加入6孔細胞培養(yǎng)板中，1.0 ml/孔，每個濃度3孔，放5% CO2、37℃細胞培養(yǎng)箱。給藥第3天，更換原濃度替芬泰藥液，給藥第6天，收取細胞上清，細胞用除RNA酶的PBS溶液洗滌3次，每孔加入1 ml Trizol裂解，裂解液用RNA提取試劑盒提取細胞內(nèi)總RNA。

1.4觀察指標及檢測方法

1.4.1觀察指標

將觀察組與對照組進行比較，觀察兩組HepG2 A64細胞中，基因水平表達差異10倍、1.5倍的情況。

1.4.2觀察指標的檢測方法

1.4.2.1細胞培養(yǎng) ?選用對數(shù)生長期的A64細胞，用0.02%的EDTA洗兩遍，加入0.25%胰蛋白酶1 ml，靜置消化3～5 min，輕輕吹散細胞成單個狀態(tài)，計數(shù)到2×105個細胞/ml，接種至6孔細胞培養(yǎng)板中，1.0 ml/孔。放入5% CO2、37℃細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待細胞貼壁后進行實驗。

1.4.2.2基因表達的檢測 ?樣品總RNA送上海歐易生物醫(yī)學(xué)科技有限公司，利用NanoDrop ND-2000（Thermo Scientific）定量并經(jīng)Agilent Bioanalyzer 2100（Agilent Technologies）檢測RNA完整性。RNA質(zhì)檢合格后，樣本的標記、芯片的雜交以及洗脫參照芯片標準流程。首先，總RNA反轉(zhuǎn)錄成雙鏈cDNA，再進一步合成用Cyanine-3-CTP（Cy3）標記的cRNA。標記好的cRNA和芯片雜交，洗脫后利用Agilent Scanner G2505C（Agilent Technologies）掃描，得到原始圖像。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法

采用Feature Extraction軟件（version10.7.1.1，Agilent Technologies）處理原始圖像，提取原始數(shù)據(jù)。接著利用Genespring軟件（version 12.5，Agilent Technologies）進行quantile標準化和后續(xù)處理。標準化后的數(shù)據(jù)進行過濾，在用于比較的每組樣本中至少有一組100%標記為Detected的探針留下進行后續(xù)分析。利用t檢驗的P值和倍數(shù)變化值進行差異基因篩選，篩選的標準為上調(diào)或者下調(diào)倍數(shù)變化值≥2.0且P值≤0.05。接著，對差異基因進行GO和KEGG富集分析，以判定差異基因主要影響的生物學(xué)功能或者通路。最后，對差異基因進行非監(jiān)督層次聚類，利用熱圖的形式展示差異基因在不同樣本間的表達模式。

2結(jié)果

2.1觀察組與對照組細胞基因表達水平的比較

實驗結(jié)果提示，觀察組細胞與對照組細胞的基因表達水平比較，許多基因的表達出現(xiàn)相應(yīng)的上調(diào)或下調(diào)，編碼基因中表達差異10倍以上的基因有11個（表1），表達上調(diào)的基因中，免疫相關(guān)基因有白介素-21受體（IL-21R）基因。

2.2替芬泰處理HepG2 A64細胞差異表達1.5倍以上的基因

由于替芬泰抗HBV的作用較為溫和，本研究把差異表達倍數(shù)在1.5倍以上的基因全部取出，應(yīng)用KEGG通路分析，發(fā)現(xiàn)替芬泰處理細胞后有9個差異表達倍數(shù)在1.5倍以上的胞內(nèi)小分子蛋白參與HBV感染相關(guān)分子調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)，從而通過干預(yù)胞內(nèi)信號通路傳導(dǎo)發(fā)揮體外抗HBV作用，見表2、圖1、圖2。

3討論

替芬泰是馬蹄金素的衍生物，其在乙肝病毒試驗篩選的結(jié)果顯示較強的抗HBV活性[5]。為了深入研究替芬泰抗HBV作用機制，本研究進行了體內(nèi)外抗HBV試驗的深入研究，結(jié)果有所發(fā)現(xiàn)。

本研究結(jié)果提示，觀察組細胞與對照組細胞比較，許多基因的表達出現(xiàn)相應(yīng)的上調(diào)或下調(diào)，編碼基因中表達差異10倍以上的基因有11個。而梁光義[6]的研究結(jié)果也顯示，替芬泰對HepG2 A64具有抗HBV的作用。由于替芬泰抗HBV的作用較為溫和，本研究把差異表達倍數(shù)在1.5倍以上的基因全部取出，應(yīng)用KEGG通路分析，發(fā)現(xiàn)替芬泰處理細胞后有9個差異表達倍數(shù)在1.5倍以上的胞內(nèi)小分子蛋白參與HBV感染相關(guān)分子調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)，從而通過干預(yù)胞內(nèi)信號通路傳導(dǎo)發(fā)揮體外抗HBV作用。表達上調(diào)10倍以上的基因有5種，下調(diào)10倍以上的基因有6種。表達上調(diào)的基因中免疫相關(guān)基因有IL-21R基因。IL-21R很有可能與替芬泰的抗病毒機制有關(guān)[7]。鄭春新[8]的研究也表明，IL-21R信號通路可抑制肝癌生長。近期的一項研究顯示，急性HBV感染患者血液中HBcAg特異的分泌IL-21的CD4+T細胞比慢性HBV感染患者多，提示乙型肝炎核心抗原（HBcAg）特異的分泌IL-21的CD4+T細胞對于控制HBV感染起到一定的作用[9];上調(diào)的p21分子，抑制早期細胞周期檢測點去調(diào)節(jié)作用使細胞增殖速率減緩;Bcl2基因編碼26KD的膜結(jié)合蛋白，可結(jié)合于線粒體外膜、滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及核膜上，抑制由多種刺激信號引起的凋亡。Bcl2可能作用于Fas的信號傳導(dǎo)途徑，阻止Bax插入到線粒體膜上和由Bax引起的細胞色素C的釋放。但Bcl2抑制凋亡的確切機制仍不明確[10]。Bcl2在正常肝細胞中并不表達，僅在部分肝腫瘤中可被檢測到。由于Fas在肝臟細胞中呈持續(xù)表達，故Bcl2可保護肝癌細胞，包括DNA受損的細胞逃脫Fas介導(dǎo)的凋亡。因此，Bcl2可能涉及肝癌發(fā)生的某些機制，如通過下調(diào)細胞膜上的Fas表達量來發(fā)揮其抑制凋亡的作用，但具體機制有待進一步研究[11]。鈣依賴性酪氨酸激酶-2（calcium-dependent proline-rich tyrosine kinase-2，Calcium-Pyk2）信號通路是目前明確可影響HBV復(fù)制的環(huán)節(jié)之一。研究證實HBx蛋白促使該信號通路中Pyk2及FAK的磷酸化，下調(diào)Src激酶通路，促進HBV DNA的復(fù)制，但這一過程可被線粒體鈣通道阻滯劑環(huán)胞素A（Cyclosporin A，CsA）和胞漿鈣抑制劑BAPTA-AM所逆轉(zhuǎn)，并下調(diào)HBV DNA在胞內(nèi)復(fù)制及病毒抗原的分泌[12-15]。

綜上所述，經(jīng)替芬泰處理細胞基因表達水平出現(xiàn)相應(yīng)的上調(diào)或下調(diào)，表達差異大，可由表達譜基因芯片結(jié)果推測替芬泰可通過調(diào)控HBV復(fù)制下游Calcium-Pyk2信號通路和p21因子，從而對HBx蛋白的功能產(chǎn)生影響，達到抑制HBV復(fù)制的作用;并可通過影響細胞IL-21、Bcl-2等免疫因子提高細胞抗HBV作用。

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（收稿日期：2019-04-04 ?本文編輯：孟慶卿）