盧超，單秀紅，熊非，顧寧，陳芹

(1江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院，江蘇鎮(zhèn)江 212002；2東南大學(xué)生物科學(xué)與醫(yī)學(xué)工程學(xué)院)

間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)是一類來源于中胚層的多能干細(xì)胞，具有特異向多種腫瘤及其轉(zhuǎn)移灶歸巢遷移的能力。目前，MSCs向腫瘤定向遷移的確切機制尚不十分清楚，MSCs促進或抑制腫瘤增殖亦存在爭議[1]。選擇合適的方式對MSCs標(biāo)記、示蹤，在活體內(nèi)檢測細(xì)胞的遷移、增殖、分化等狀態(tài)，有助于解決上述問題。超順磁性氧化鐵(SPIO)為磁共振成像(MRI)陰性對比劑，國內(nèi)外報道將商用SPIO如Feridex標(biāo)記MSCs進行體內(nèi)外示蹤研究，然而SPIO需要借助轉(zhuǎn)染劑如多聚賴氨酸等標(biāo)記細(xì)胞，但轉(zhuǎn)染劑可影響細(xì)胞活力及分化能力[2]。本研究將2-脫氧-D-葡萄糖(2-DG)修飾的SPIO(γ-Fe2O3@DMSA-DG NPs)直接標(biāo)記人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(hUCMSCs)，觀察其標(biāo)記效率，并觀察其對細(xì)胞活性、遷移能力的影響及體外磁共振成像，為磁標(biāo)記hUCMSCs的MRI活體示蹤奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 二巰基丁二酸(DMSA)購于上海貝合化工有限公司，1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)購于美國Pierce Chemical有限公司，D-氨基葡萄糖鹽酸鹽購于德國Alfa Aesar GmbH&Co KG公司，透射電鏡(JEM-2000EX)購于日本JEOL公司，紅外光譜檢測儀購于美國Nicolet公司。

1.2 γ-Fe2O3@DMSA-DG NPs的制備與鑒定 采用化學(xué)共沉淀法合成γ-Fe2O3NPs，將100 mg γ-Fe2O3溶于10 mL氯仿，再加入50 μL三乙胺。將50 mg DMSA溶于10 mL二甲基亞砜，然后添加到γ-Fe2O3溶液。將混合液保持60 ℃振蕩12 h，形成黑色沉積物γ-Fe2O3@DMSA NPs。將1 mL EDC和1 mL NHS、8 mL雙蒸水分別加入10 mL γ-Fe2O3@DMSA NPs，室溫下反應(yīng)30 min，加入10 mL D-氨基葡萄糖鹽酸鹽，2 h后，用雙蒸水對溶液進行透析純化，形成γ-Fe2O3@DMSA-DG NPs樣品。通過透射電鏡觀察納米粒子形態(tài)，計算其平均粒徑。采用紅外光譜檢測儀觀察粒子表面結(jié)構(gòu)。最終成功合成γ-Fe2O3@DMSA-DG NPs，該納米粒呈近球形，粒徑10 nm；水合粒徑為(156.2±28.2)nm。飽和磁化強度為49.67 emu/g，Zeta電位為(-10.22±0.81)mV。紅外光譜圖示γ-Fe2O3@DMSA-DG NPs出現(xiàn)C—N伸縮振動峰(1 107/cm)。納米粒涂層DMSA與2-DG的結(jié)合率約為60%(羧基∶2-DG=10∶6)。

1.3 hUCMSCs的分離、培養(yǎng) 健康新生兒臍帶取自江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院婦產(chǎn)科足月剖宮產(chǎn)的胎兒，其獲取得到了醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn)和患者的知情同意。將臍帶用生理鹽水沖洗干凈，用剪刀鑷子剔去血管，將剝離的華氏膠組織剪碎至1 mm3大小，加入低糖DMEM培養(yǎng)液，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)液中含10% FBS、100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素。待細(xì)胞長滿后，用0.25%胰蛋白酶消化傳代。組織塊貼壁后1周可見組織塊周圍爬出細(xì)小梭形細(xì)胞；14 d時細(xì)胞貼滿瓶底，此時呈漩渦狀、輻射狀或網(wǎng)狀排列。傳代后細(xì)胞生長迅速，呈梭形或成纖維狀，3 d可傳1代。

1.4 γ-Fe2O3@DMSA-DG NPs體外標(biāo)記hUCMSCs的效率測算 采用普魯士藍(lán)染色。于37 ℃、5% CO2、飽和濕度下，將hUCMSCs置于γ-Fe2O3@DMSA-DG NPs鐵濃度分別為0、8、16、32、64、128 μg/mL的含10%胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)液連續(xù)孵育24 h，以未與納米鐵孵育(鐵濃度為0 μg/mL)的細(xì)胞作為對照組。將磁標(biāo)記hUCMSCs接種于12孔板，吸取上清，用PBS洗滌3次，以4%多聚甲醛固定10 min，加入等量10%亞鐵氰化鉀、20%鹽酸混合液，30 min后雙蒸水沖洗3次，核固紅復(fù)染15 min，再用雙蒸水充分清洗。于顯微鏡200倍鏡下觀察，hUCMSCs細(xì)胞核呈紅色，納米鐵呈藍(lán)色位于細(xì)胞內(nèi)，表明標(biāo)記成功。任意選取5個視野，標(biāo)記率=總標(biāo)記細(xì)胞/總視野中所有細(xì)胞×100%。

1.5 γ-Fe2O3@DMSA-DG NPs標(biāo)記hUCMSCs細(xì)胞活力檢測 采用CCK-8法。取第3代hUCMSCs按2 000個/孔接種96孔板，待細(xì)胞貼壁后，將梯度鐵濃度γ-Fe2O3@DMSA-DG NPs(0、8、16、32、64、128 μg/mL)培養(yǎng)基與細(xì)胞孵育24 h后棄上清液，PBS清洗3遍，每孔加入含10%胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)液100 μL及10 μL CCK-8試劑，置于溫箱孵育2 h，于450 nm波長測量OD值。每個濃度設(shè)3個復(fù)孔，以鐵濃度0 μg/mL為對照組，空白組僅含低糖DMEM培養(yǎng)液及CCK-8試劑，取全部結(jié)果的平均值。細(xì)胞活力(%)=(OD實驗組-OD空白組)/(OD對照組-OD空白組)×100%。

1.6 γ-Fe2O3@DMSA-DG NPs標(biāo)記hUCMSCs遷移能力檢測 采用Transwell遷移實驗。將梯度鐵濃度γ-Fe2O3@DMSA-DG NPs(8、16、32、64、128 μg/mL)培養(yǎng)基與細(xì)胞孵育24 h后將hUCMSCs細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，細(xì)胞計數(shù)，離心后棄上清，用含1%胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀，并調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個/mL。取24孔板，向孔中鋪入三陰性乳腺癌細(xì)胞BT549，待細(xì)胞貼壁融合80%時，吸棄上清，加入600 μL含10%胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)基，然后將Transwell小室放入孔中。取上述磁標(biāo)記hUCMSCs細(xì)胞懸液200 μL分別加入已備好的不同小室中，將24孔板置于37 ℃、5% CO2孵箱中孵育24 h。隨后甩去上層液體，PBS清洗小室，用濕棉簽輕輕擦拭除去小室膜上層的細(xì)胞，多聚甲醛固定10 min后，普魯士藍(lán)染色30 min，伊紅復(fù)染20 min，200倍鏡下取上下左右中5個視野計數(shù)細(xì)胞個數(shù)。

1.7 γ-Fe2O3@DMSA-DG NPs標(biāo)記hUCMSCs細(xì)胞群MRI成像觀察 將梯度鐵濃度γ-Fe2O3@DMSA-DG NPs(8、16、32、64、128 μg/mL)培養(yǎng)基與hUCMSCs連續(xù)孵育24 h，吸去培養(yǎng)基，用PBS洗滌3次，胰蛋白酶消化，將4.2×105個細(xì)胞均勻混懸于0.5%瓊脂糖中固定，置于EP管中，其中鐵濃度0 μg/mL為對照組。采用Siemens Avanto 1.5T MR掃描儀，相控陣8通道頭線圈，軸位T2WI采用TR 5 500 ms，TE 100 ms，層厚2 mm，矩陣256×256，觀測圖像信號變化。采用自旋多回波脈沖序列(TR=3 000 ms，TE=22～352 ms，16個回波，矩陣256×256，層厚3 mm)，將圖像傳輸?shù)組RI系統(tǒng)配備工作站，生成T2圖，選擇3個大小一致的感興趣區(qū)測量橫向弛豫時間(T2)，取均值，計算橫向弛豫率(R2)，R2=1/T2。

2 結(jié)果

2.1 γ-Fe2O3@DMSA-DG NPs體外標(biāo)記hUCMSCs的效率 鐵濃度為8、16、32、64、128 μg/mL時，hUCMSCs標(biāo)記率分別為80.74%、90.80%、96.91%、99.56%、99.58%，細(xì)胞內(nèi)藍(lán)染顆粒數(shù)量隨鐵濃度升高而逐級增加。

2.2 γ-Fe2O3@DMSA-DG NPs標(biāo)記hUCMSCs細(xì)胞活力 空白組、對照組及8、16、32、64、128 μg/mL鐵標(biāo)記hUCMSCs OD值分別為0.163±0.005、0.291±0.011、0.277±0.007、0.273±0.024、0.274±0.004、0.276±0.008、0.273±0.003。8、16、32、64、128 μg/mL鐵標(biāo)記hUCMSCs細(xì)胞活力分別為90.5%、87.3%、88.1%、89.7%、87.3%，各鐵濃度標(biāo)記細(xì)胞活力與對照組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。

2.3 γ-Fe2O3@DMSA-DG NPs標(biāo)記hUCMSCs遷移能力 對照組及8、16、32、64、128 μg/mL鐵標(biāo)記hUCMSCs遷移細(xì)胞數(shù)分別為(151.4±9.89)、(141.4±5.55)、(154.6±4.83)、(152.4±7.77)、(150.6±8.38)、(47.8±2.28)個，128 μg/mL鐵標(biāo)記細(xì)胞與對照組相比P<0.01。

2.4 γ-Fe2O3@DMSA-DG NPs標(biāo)記hUCMSCs MRI檢測結(jié)果 對照組及8、16、32、64、128 μg/mL鐵標(biāo)記hUCMSCs T2圖測的T2值分別為(115.83±2.24)、(88.70±1.97)、(82.87±1.52)、(80.70±0.78)、(62.36±1.70)、(52.50±1.65)ms，各濃度鐵標(biāo)記細(xì)胞T2值與對照組相比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。相關(guān)性分析顯示，hUCMSCs細(xì)胞群R2值與培養(yǎng)基γ-Fe2O3@DMSA-DG NPs鐵濃度呈正相關(guān)(r=0.964，P<0.05)。

3 討論

MSCs可以定向遷移至靶組織，如損傷、炎癥及腫瘤部位。SPIO與MRI成像相結(jié)合能夠標(biāo)記和示蹤MSCs。hUCMSCs取材方便、無免疫排斥、分化能力強，本研究探討利用2-DG標(biāo)記的SPIO孵育hUCMSCs，在有效磁標(biāo)記hUCMSCs的前提下，最大程度維持hUCMSCs的活力和遷移能力。

SPIO的生物相容性及攝取同納米直徑和表面特性相關(guān)[3]。本研究中SPIO核心為γ-Fe2O3，水合粒徑為156 nm，表面修飾物DMSA不影響細(xì)胞活力，與細(xì)胞具有良好的親和性[4]，可增加SPIO在細(xì)胞中的吸收[5]。同時包被DMSA的納米鐵進一步標(biāo)記葡萄糖類似物2-DG，借助靶向配體2-DG與細(xì)胞膜葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白(GLUT)的特異性結(jié)合，增強了受體介導(dǎo)的胞吞。前期研究顯示，2 h內(nèi)，γ-Fe2O3@DMSA-DG NPs可被高葡萄糖代謝的乳腺癌MDA-MB-231及MCF-7細(xì)胞[6]、前列腺癌PC3細(xì)胞[7]靶向吸收。本研究顯示，無需借助轉(zhuǎn)染劑，該納米鐵24 h可被hUCMSCs有效吸收，當(dāng)鐵濃度為32 μg/mL時，hUCMSCs標(biāo)記率即可近97%。

研究[8]表明，適當(dāng)濃度下SPIO標(biāo)記MSCs后不會對細(xì)胞活力、增殖及分化能力造成明顯影響。理想狀態(tài)下，細(xì)胞內(nèi)鐵含量越高，磁共振信號變化越大。然而，安全標(biāo)記濃度條件下，細(xì)胞內(nèi)鐵負(fù)重可影響細(xì)胞遷移能力，進而影響活體成像的追蹤觀察。本研究顯示，2-DG標(biāo)記的納米鐵在8～128 μg/mL鐵濃度條件下，細(xì)胞活力均未見顯著性降低。MSC特異性遷移到靶器官，需跨越血管內(nèi)皮細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)。hBMSCs穿過骨髓內(nèi)皮細(xì)胞時，hBMSCs在形態(tài)上展開并伸出偽足，以足絲狀突起的形式鉆進內(nèi)皮細(xì)胞。懸浮的MSCs的平均直徑為15～19 μm[9]，本研究中Transwell膜孔徑為8 μm，上室中的磁標(biāo)記hUCMSCs穿過小孔到達下室，模擬了體內(nèi)MSCs跨內(nèi)皮細(xì)胞游出內(nèi)皮的過程。本研究結(jié)果顯示，當(dāng)培養(yǎng)液鐵濃度為128 μg/mL時，hUCMSCs遷移能力顯著下降。

在不影響細(xì)胞遷移能力的前提下，hUCMSCs細(xì)胞內(nèi)SPIO含量越高，T2馳豫時間縮短越明顯，即MRI T2信號差異越大。SPIO可顯著降低T2弛豫時間,很小濃度的SPIO即可使T2信號降低。本研究各濃度鐵標(biāo)記細(xì)胞T2值均較對照組低。相關(guān)研究[10]常采用MRI掃描序列中信號強度變化檢測不同鐵濃度SPIO。T2值可對物質(zhì)信號強度量化表達。李春燕等[11]應(yīng)用MRI多回波掃描并測量T2值，并計算R2值，發(fā)現(xiàn)含鐵水模T2值與含鐵水模鐵濃度呈函數(shù)關(guān)系，含鐵水模R2值與含鐵水模鐵濃度呈直線相關(guān)，認(rèn)為R2值能夠?qū)w外不同鐵濃度進行定量評估。本研究中，隨著鐵濃度升高，細(xì)胞內(nèi)鐵顆粒逐級增加，磁標(biāo)記hUCMSCs R2值同標(biāo)記鐵濃度呈直線相關(guān)，符合這一規(guī)律。

Baghchechi等[12]將30 μg/mL鐵的Feridex直接與人神經(jīng)干細(xì)胞孵育24 h，細(xì)胞磁標(biāo)記率達到85%。吳莉等[8]將25、50、75、100 μg/mL鐵的SPIO(Sigma公司)-PLL混合液，張瑞平等[13]將25、50、100和150 μg/mL鐵SPIO(德國Schering公司)-PLL混合液，分別用于標(biāo)記BMSCs,發(fā)現(xiàn)各組細(xì)胞標(biāo)記率可達到100%，但100 μg/mL鐵標(biāo)記濃度均影響細(xì)胞活性。Mishra等[14]研究顯示，50 μg/mL鐵的氧化鐵-PLL混合液為最適標(biāo)記鐵濃度。本課題組合成γ-Fe2O3@DMSA-DG NPs較商用SPIO-PLL混合液具有更好的生物相容性，更高的安全標(biāo)記濃度下，細(xì)胞內(nèi)鐵含量更高。在64 μg/mL鐵標(biāo)記濃度條件下，標(biāo)記率達到99.56%，納米鐵標(biāo)記細(xì)胞T2值較低濃度標(biāo)記細(xì)胞明顯降低，說明細(xì)胞內(nèi)鐵含量較低濃度標(biāo)記細(xì)胞明顯增多，而干細(xì)胞遷移能力仍未受明顯影響，因此該納米鐵顆粒是較為理想的hUCMSCs標(biāo)記材料。

可見，本研究制備的γ-Fe2O3@DMSA-DG NPs易于被hUCMSCs攝取，鐵濃度為64 μg/mL即可達到有效標(biāo)記，對細(xì)胞活力及遷移能力無明顯影響，又可被MR T2WI序列檢測。