程鳳鳳，于靜，張曉瑩，房愛菊，金作偉

(1山東省立第三醫(yī)院，濟(jì)南 250031；2濟(jì)南齊魯醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所)

宮頸癌是嚴(yán)重威脅女性健康的惡性腫瘤，其發(fā)病率位居女性惡性腫瘤的首位，全世界每年大約有53萬新發(fā)病例和27萬死亡病例，且大約85%死亡病例發(fā)生在不發(fā)達(dá)國家或者發(fā)展中國家，其病死率是發(fā)達(dá)國家的18倍[1]。目前雖然宮頸癌手術(shù)以及放化療技術(shù)取得了突破性的進(jìn)展，但絕大多數(shù)中晚期患者仍然預(yù)后不良。宮頸癌分子的異質(zhì)性改變是導(dǎo)致宮頸癌放化療抵抗、遷移及進(jìn)展的主要原因[2]。因此，進(jìn)一步尋找宮頸癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，對(duì)于提高中晚期宮頸癌患者生存率、提高生存質(zhì)量意義重大。Twist即扭曲因子，具有高度保守的堿性螺旋—環(huán)—螺旋結(jié)構(gòu)，是一種具有調(diào)控作用的轉(zhuǎn)錄因子，在腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡以及侵襲轉(zhuǎn)移中均具有重要的調(diào)控作用[3]。目前研究已經(jīng)證實(shí)Twist參與多種腫瘤的形成，包括乳腺癌以及前列腺癌等[4,5]。研究發(fā)現(xiàn)，Twist在宮頸癌組織中高表達(dá)，且Twist高表達(dá)的患者預(yù)后不良[6]，但其在宮頸癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用機(jī)制尚未闡明。2014年10月～2017年12月，本研究以宮頸癌癌細(xì)胞株Hela以及人宮頸永生化上皮細(xì)胞H8為研究對(duì)象，旨在觀察Twist在宮頸癌細(xì)胞系侵襲轉(zhuǎn)移中的作用，為開發(fā)宮頸癌新基因靶向治療提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 DMEM高糖培養(yǎng)基、RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清以及胰酶等購自美國Hyclone公司；由Invitrogen公司構(gòu)建慢病毒載體；Twist抗體購自美國GeneTex公司；Rac1以及MMP-2抗體購自Cell Signaling Technology公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒購自北京碧云天生物技術(shù)公司；高速冷凍多用途離心機(jī)購自德國Eppendorf Centyifuge。

1.2 細(xì)胞來源、分組及培養(yǎng) 宮頸癌細(xì)胞株Hela以及人宮頸永生化上皮細(xì)胞H8細(xì)胞購自上海生命科學(xué)院細(xì)胞和生物化學(xué)研究所。Hela細(xì)胞生長于含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基中(加入100 U/mL青霉素以及50 U/mL鏈霉素)，于37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天換液1次，融合度長至80%左右時(shí)用0.25%胰酶消化后接種至6孔板中。每孔加入含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基3 mL繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3 Twist慢病毒過表達(dá)或沉默載體轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞 構(gòu)建Twist基因過表達(dá)質(zhì)粒以及敲減質(zhì)粒，并將其與病毒包裝質(zhì)粒轉(zhuǎn)入293T，48 h后收集病毒，0.22 μm的濾器過濾后濃縮病毒，-80 ℃保存。實(shí)驗(yàn)前保證細(xì)胞的良好生長狀態(tài)，取8×104個(gè)處于對(duì)數(shù)生長期的Hela細(xì)胞，接種于6孔板中，接種3個(gè)孔，分別為對(duì)照組、過表達(dá)組、沉默組。感染前為細(xì)胞換新鮮基礎(chǔ)培養(yǎng)基，以復(fù)感染指數(shù)(MOI)值20，加入感染培養(yǎng)基(基礎(chǔ)培養(yǎng)基1 mL+5 mg/L Polybrene)和相應(yīng)的病毒量(病毒量體積=MOI×細(xì)胞數(shù)目/病毒滴度，對(duì)照組1.8 μL,過表達(dá)組3.4 μL，沉默組4 μL)。24 h后，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)12 h，更換新鮮基礎(chǔ)培養(yǎng)基，72 h后熒光鏡觀察感染率。

1.4 細(xì)胞侵襲能力檢測 采用boyden侵襲實(shí)驗(yàn)。用胰酶將上述過表達(dá)組、沉默組以及對(duì)照組對(duì)數(shù)生長期的Hela消化制成單細(xì)胞懸液。聚碳酸酯微孔膜(孔徑8 μm)分布于運(yùn)動(dòng)小室和侵襲小室的上下室之間，侵襲小室濾膜上包被人工基底膠，將人工基底膠置于室溫下，無血清的培養(yǎng)基水化2 h。小室的下室均加含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基作為趨化因子，上室加入細(xì)胞懸液(細(xì)胞數(shù)約1×105)。37 ℃、5% CO2飽和濕度下培養(yǎng)，12 h后，分別取出聚碳酸酯微孔膜，中性甲醛固定，蘇木素染色。在200倍光鏡下隨機(jī)計(jì)數(shù)5個(gè)視野計(jì)數(shù)，取其均值代表細(xì)胞侵襲力。

1.5 細(xì)胞遷移能力檢測 采用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)。用胰酶將上述過表達(dá)組、沉默組以及對(duì)照組的對(duì)數(shù)生長期的Hela消化制成單細(xì)胞懸液。將細(xì)胞均勻鋪置6孔板中，每孔2×106個(gè)細(xì)胞，將其置于培養(yǎng)箱中，待細(xì)胞貼壁后約8 h，用10 μL的槍頭沿直尺方向做兩條劃痕，PBS沖洗3次后，加入無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)。于倒置顯微鏡下每24 h記錄1次細(xì)胞遷移情況。

1.6 細(xì)胞中Twist、MMP-2、Rac1表達(dá)檢測 采用Western blotting法。收集H8、Hela細(xì)胞及Twist對(duì)照組、過表達(dá)組、沉默組細(xì)胞，RIPA冰上液裂解細(xì)胞15 min后將其置于超聲儀中繼續(xù)裂解10 min后離心(12 000 g，4 ℃，15 min)；蛋白濃度用BCA分析試劑測定；配膠，上樣50 μg/孔，跑膠，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜，5% BSA封閉2 h，加一抗孵育過夜，TBST洗滌，二抗孵育2 h，TBST洗滌，化學(xué)發(fā)光底物檢測；X光片曝光顯影、定影顯示陽性條帶，GAPDH作為內(nèi)參。Image J軟件測量灰度值并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞中Twist蛋白表達(dá)比較 H8、Hela細(xì)胞中Twist蛋白的相對(duì)表達(dá)量分別為1.67±0.31、6.87±2.17，兩者比較P<0.05。轉(zhuǎn)染Twist基因過表達(dá)載體后，對(duì)照組、過表達(dá)組、沉默組中Twist蛋白的相對(duì)表達(dá)量分別為3.97±0.48、8.23±0.74、0.48±0.23，過表達(dá)組、沉默組與對(duì)照組相比，P均<0.05。

2.2 各組細(xì)胞侵襲能力比較 對(duì)照組、過表達(dá)組、沉默組穿膜細(xì)胞數(shù)分別為(41.38±11.32)、(281.38±12.32)、(11.28±14.32)個(gè)，過表達(dá)組、沉默組與對(duì)照組相比，P均<0.05。

2.3 各組細(xì)胞遷移能力比較 對(duì)照組、過表達(dá)組、沉默組細(xì)胞劃痕愈合比分別為(31.43±5.22)%、(64.27±9.43)%、(14.16±5.21)%，過表達(dá)組、沉默組與對(duì)照組相比，P均<0.05。

2.4 各組細(xì)胞Rac1、MMP-2蛋白表達(dá)比較 對(duì)照組Rac1、MMP-2相對(duì)表達(dá)量分別為1.76±2.35、1.07±2.13，過表達(dá)組分別為3.78±2.76、4.24±1.97，沉默組分別為0.46±1.43、0.37±1.53，過表達(dá)組、沉默組與對(duì)照組相比，P均<0.05。

3 討論

宮頸癌是嚴(yán)重威脅女性健康的惡性腫瘤，其早診率低，復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移率高，預(yù)后較差。目前研究已經(jīng)表明，基因突變是導(dǎo)致腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素，尋找導(dǎo)致宮頸癌發(fā)生的特異性基因?qū)τ趯m頸癌的診斷及治療都有著重要意義。Twist基因在動(dòng)物與人類的生長發(fā)育以及胚胎形成中起關(guān)鍵調(diào)控作用，可以誘導(dǎo)細(xì)胞移動(dòng)以及組織塑性[13]。有研究發(fā)現(xiàn)Twist與腫瘤的發(fā)生關(guān)系密切。如Han等[14]發(fā)現(xiàn)在乳腺癌中，Twist的表達(dá)明顯升高，且與復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)；此外，一方面Twist可以調(diào)控EMT促進(jìn)骨肉瘤的增殖、侵襲以及轉(zhuǎn)移[15]，另一方面Twist還可通過調(diào)控血管內(nèi)皮生長因子促進(jìn)腫瘤新生血管形成，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移等[16]。由此推測Twist在宮頸癌中也有同樣作用。因此，本研究以Hela細(xì)胞以及H8細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)材料，檢測Twist在宮頸癌細(xì)胞以及正常細(xì)胞株中的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Twist在Hela細(xì)胞中表達(dá)顯著高于H8；繼而采用慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)過表達(dá)和沉默Twist基因后轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)一步研究Twist在宮頸癌細(xì)胞中發(fā)揮的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染Twist慢病毒過表達(dá)載體后細(xì)胞中Twist表達(dá)明顯升高，功能實(shí)驗(yàn)顯示細(xì)胞的侵襲能力和遷移能力顯著升高。上述結(jié)果提示高表達(dá)的Twist促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移，與李雪蓮等[17]研究發(fā)現(xiàn)Twist高表達(dá)促進(jìn)宮頸癌侵襲轉(zhuǎn)移的結(jié)果一致，但其作用的具體機(jī)制尚不明確。

侵襲轉(zhuǎn)移是腫瘤的主要惡性生物學(xué)行為，是導(dǎo)致大部分腫瘤治療失敗的主要原因。腫瘤TNM分期高低的一個(gè)主要指標(biāo)是有無遠(yuǎn)處侵襲轉(zhuǎn)移。大部分癌基因之所以在腫瘤進(jìn)展中發(fā)揮著關(guān)鍵調(diào)控作用，其主要原因是其可以促使腫瘤早期轉(zhuǎn)移，而腫瘤是否發(fā)生早期轉(zhuǎn)移決定了患者的預(yù)后[18]。研究[19]發(fā)現(xiàn)，Twist可以調(diào)控Rac1進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞遷移。Rac1是細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，可以調(diào)控腫瘤的惡性轉(zhuǎn)化、侵襲轉(zhuǎn)移以及腫瘤血管形成等[20]。目前有研究報(bào)道Rac1可以通過調(diào)控基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP-2)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移[21]。MMP-2主要作用是降解細(xì)胞外基質(zhì)[22]。MMP-2編碼基因位于16q21上，較其他MMP相比，MMP-2催化區(qū)含有半胱氨酸嵌入物，在與膠原蛋白以及彈力蛋白結(jié)合過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[23]。有研究[21]證實(shí)，MMP-2在腫瘤細(xì)胞的生長、侵襲轉(zhuǎn)移、腫瘤血管形成以及免疫調(diào)節(jié)等過程中均起著重要作用。本研究通過轉(zhuǎn)染Twist慢病毒過表達(dá)載體和Twist慢病毒沉默載體至Hela細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，敲減Twist后，細(xì)胞中Rac1和MMP-2的表達(dá)顯著降低，過表達(dá)Twist后，Rac1與MMP-2的表達(dá)水平顯著升高，表明Twist可能通過促進(jìn)Rac1和MMp-2的表達(dá)促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。

綜上所述，Twist在宮頸癌細(xì)胞株Hela中高表達(dá)，促進(jìn)/抑制其表達(dá)可以顯著增強(qiáng)/降低Hela的侵襲轉(zhuǎn)移，機(jī)制可能是通過作用于侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白R(shí)ac1、MMP-2的表達(dá)進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。本研究為治療宮頸癌提供新的策略，Twist可能成為宮頸癌治療的潛在靶點(diǎn)。