馮相鑫，夏成興，王海峰，楊德林

(昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院，昆明 650101)

細(xì)胞自噬是一種高度進(jìn)化保守的分解代謝活動(dòng)，能夠?qū)⑹軗p老化細(xì)胞器包裹在特殊的膜結(jié)構(gòu)中形成自噬體，并送入溶酶體降解。細(xì)胞自噬持續(xù)存在并遍及人體全身細(xì)胞。根據(jù)細(xì)胞受到代謝壓力的大小，自噬可分為基礎(chǔ)自噬和誘導(dǎo)自噬兩種。健康狀況下，自噬處于基礎(chǔ)水平，對細(xì)胞的正常內(nèi)環(huán)境起到監(jiān)視作用；當(dāng)細(xì)胞處于低氧、藥物作用或射線等應(yīng)激環(huán)境下，自噬水平將顯著提高，分解代謝活動(dòng)加強(qiáng)以適應(yīng)細(xì)胞新的能量需求狀態(tài)。自噬在細(xì)胞的動(dòng)態(tài)平衡等過程中扮演重要角色。自噬異常與惡性腫瘤、帕金森病等神經(jīng)退行性病變、克羅恩病等炎癥性病變、腎小球硬化癥及白內(nèi)障等疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。細(xì)胞自噬有三種途徑：①在沒有自噬泡的形成的條件下，溶酶體直接內(nèi)化并降解受損細(xì)胞器的過程稱為微自噬；②分子伴侶先與靶蛋白結(jié)合，之后轉(zhuǎn)運(yùn)到溶酶體中降解的過程稱為分子伴侶介導(dǎo)的自噬；③細(xì)胞內(nèi)形成的錯(cuò)誤蛋白或受損細(xì)胞器先被特殊的雙層膜結(jié)構(gòu)包裹之后再與溶酶體融合，進(jìn)而將待降解底物送入溶酶體進(jìn)行降解的過程稱為巨自噬，降解后產(chǎn)生的的小分子物質(zhì)又以合成新的蛋白質(zhì)或產(chǎn)生能量的方式被機(jī)體利用。巨自噬是現(xiàn)階段關(guān)于細(xì)胞自噬研究的焦點(diǎn)。在生理?xiàng)l件下，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)、活性氧和受損的線粒體時(shí)，適當(dāng)水平的自噬能夠發(fā)揮清除作用，避免因代謝應(yīng)激增加引起的DNA損傷，進(jìn)而提前抑制了腫瘤的發(fā)生。在腫瘤形成后，自噬能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的存活，其主要機(jī)制是腫瘤細(xì)胞通過利用自噬產(chǎn)生的能量加強(qiáng)了在低氧和低營養(yǎng)狀態(tài)下的生存能力。 自噬水平降低和自噬誘導(dǎo)在腫瘤的形成、發(fā)展階段發(fā)揮重要作用。但目前對細(xì)胞自噬的認(rèn)識還不夠全面和成熟，精確檢測細(xì)胞自噬的方法也正在探索和完善之中，研究方法差異及研究腫瘤對象的不同常常使得研究者們對自噬所扮演的角色得出不同的結(jié)論。現(xiàn)將細(xì)胞自噬在膀胱癌發(fā)病、治療中的作用進(jìn)展綜述如下。

1 細(xì)胞自噬在膀胱癌發(fā)病中的作用

1.1 細(xì)胞自噬在膀胱癌細(xì)胞增殖中的作用 根據(jù)腫瘤所處微環(huán)境的不同，自噬發(fā)揮著抑制和促進(jìn)的雙重作用，在腫瘤發(fā)生的初始階段自噬主要起抑制腫瘤發(fā)生的作用，在晚期則主要促進(jìn)腫瘤的發(fā)展[1]。自噬基因Beclin1是一種重要的抑癌基因，Beclin1表觀遺傳學(xué)改變與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[2]。研究[3]發(fā)現(xiàn)，乳腺癌、胃癌等癌細(xì)胞中存在Beclin1基因異常甲基化，同時(shí)伴有Beclin1 mRNA及蛋白質(zhì)表達(dá)水平降低，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在胸腺癌細(xì)胞系中過表達(dá) Beclin1可抑制癌細(xì)胞的生長。 自噬是正常細(xì)胞的一種生理功能，對腫瘤的發(fā)生具有抑制作用。實(shí)體瘤組織中密集的癌細(xì)胞對氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)需求更加迫切。應(yīng)激狀態(tài)下，腫瘤細(xì)胞可利用自噬降解產(chǎn)生物質(zhì)和能量增強(qiáng)自身對抗苛刻內(nèi)環(huán)境的能力，抑制癌細(xì)胞的凋亡[4]。 Beclin1是自噬體形成過程的一個(gè)必須分子，它能夠介導(dǎo)其它參與自噬體形成的蛋白與吞噬泡結(jié)合，從而調(diào)控哺乳動(dòng)物細(xì)胞中自噬體的生成和發(fā)展。 Beclin1在腫瘤從無到有的生成以及進(jìn)一步的成熟過程中發(fā)揮重要作用，是一個(gè)重要的抑制癌癥發(fā)生的基因[5]，一方面， Beclin1依賴于 Beclin1- PI3 KC3復(fù)合體促進(jìn)吞噬泡的聚集與組裝而參與自噬體的形成，另一方面， Beclin1與其他相關(guān)蛋白共同作用而調(diào)節(jié)自噬體的成熟。有學(xué)者[6]證明，Beclin 1在BTCC組織中表達(dá)下調(diào)，并且 Beclin 1高表達(dá)與患者5年生存率的提高相關(guān)。

Sivridis等[5]研究發(fā)現(xiàn)，高分級膀胱癌患者腫瘤組織中的自噬囊泡明顯多于低分級患者，低分級患者腫瘤組織中的自噬囊又明顯多于良性前列腺增生患者；高分級膀胱癌患者腫瘤組織自噬誘導(dǎo)標(biāo)志物微管相關(guān)蛋白輕鏈3-Ⅰ(LC3-Ⅰ)向LC3-Ⅱ的轉(zhuǎn)變水平明顯高于低分級患者及良性前列腺增生患者。高、低分級膀胱癌患者的腫瘤組織中與自噬體初始形成階段相關(guān)的關(guān)鍵蛋白Beclin-1 、Atg7相對表達(dá)量增加。當(dāng)癌組織暴露于自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3 MA)中并處于同等的饑餓狀態(tài)下，高分級膀胱癌腫瘤組織細(xì)胞凋亡數(shù)明顯多于低分級膀胱癌組織，說明高分級膀胱癌組織自噬活性高。

Lin等[6]比較了人膀胱癌細(xì)胞系RT-4 、5637與膀胱上皮永生細(xì)胞SV-HUC-1的自噬活性后發(fā)現(xiàn)，與SV-HUC-1比較，RT-4 、5637細(xì)胞中自噬潮更活躍；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，自噬抑制劑Baf A1或自噬相關(guān)基因ATG-7、ATG-12的敲除可促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞的凋亡，說明自噬在膀胱癌細(xì)胞的生存、增殖中發(fā)揮積極作用。

1.2 自噬在膀胱癌細(xì)胞凋亡中的作用 正常生理狀態(tài)下，小分子物質(zhì)能夠自由通過細(xì)胞的線粒體外膜，但凋亡等特殊狀態(tài)刺激下，細(xì)胞線粒體外膜通透性增大，內(nèi)膜和外膜間隙內(nèi)與凋亡相關(guān)蛋白，如 CytC、核酸內(nèi)切酶、凋亡抑制蛋白、 線粒體蛋白Smac/ DIABLO、凋亡誘導(dǎo)因子、 熱休克蛋白60(Hsp60)、 Hsp10及核苷酸激酶等，可釋放進(jìn)入胞質(zhì)， Cyt與 apaf-1結(jié)合并聚集成凋亡體，然后 procaspase-9被凋亡體募集后變成成熟的casepase-9。成熟的casepase-9進(jìn)一步激活效應(yīng)caspase-3，裂解PARP、活化核酸內(nèi)切酶同時(shí)破壞細(xì)胞內(nèi)的多種蛋白，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。Ojha等[7]在研究中發(fā)現(xiàn)，自噬抑制劑可導(dǎo)致膀胱癌細(xì)胞凋亡細(xì)胞數(shù)增多，為進(jìn)一步探討引起癌細(xì)胞死亡的機(jī)制，他們分別測量了不同處理后的普通尿路上皮細(xì)胞和膀胱癌細(xì)胞中 casepase-8、casepase-9活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)饑餓處理后的膀胱癌細(xì)胞casepase-9活性增加，自噬抑制劑Wm/3-MA處理對casepase-9的活性沒有進(jìn)一步的影響；單獨(dú)饑餓處理后無法在膀胱癌細(xì)胞中檢測到casepase-9活性，但加入自噬抑制劑后可檢測到casepase-9活性升高。在外源性凋亡中， Procasepase-8與死亡誘導(dǎo)信號復(fù)合體(DISC)結(jié)合后， 經(jīng)同源活化形成的 casepase-8，無論是在未經(jīng)處理的還是經(jīng)過饑餓處理或自噬抑制劑處理后的正常尿路上皮細(xì)胞和膀胱癌細(xì)胞中均未檢測到；內(nèi)源性凋亡以線粒體通透性和CytC釋放入胞質(zhì)為特征，他們還檢測了不同處理下細(xì)胞膜電位的改變以及CytC的釋放，得到的結(jié)果同樣支持自噬抑制劑通過內(nèi)源性凋亡引起癌細(xì)胞凋亡。以上研究均說明，細(xì)胞自噬水平增強(qiáng)可能通過抑制細(xì)胞內(nèi)源性凋亡抑制膀胱癌細(xì)胞凋亡。

2 細(xì)胞自噬在膀胱癌治療中的作用

非肌層浸潤性膀胱癌(NMIBC)占初發(fā)膀胱腫瘤的70%，目前NMIBC 的治療主要采用經(jīng)尿道膀胱癌電切術(shù)( TUR-BT) 配合術(shù)后膀胱灌注化療，TUR-BT既是NMIBC的重要診斷方法，同時(shí)也是主要的治療手段，膀胱灌注的目的是防止腫瘤復(fù)發(fā)、延緩疾病進(jìn)展。目前膀胱癌的復(fù)發(fā)率很高，10%～30%的膀胱癌患者可能進(jìn)展為浸潤性膀胱癌(MIBC)[9]。過去20年內(nèi)，MIBC的五年生存率基本沒有變化。新輔助鉑類化療(NAC)在膀胱癌根治術(shù)前的應(yīng)用提高了非轉(zhuǎn)移性 MIBC患者7%的五年生存率[10]，但目前膀胱癌的病死率沒有發(fā)生很大的改變。因此，新治療方法的產(chǎn)生或現(xiàn)有治療方法有效率的提高將有利于膀胱癌患者的治療結(jié)果。近年來，自噬抑制劑作為輔助藥物聯(lián)合化學(xué)療法治療尿路上皮癌得到了進(jìn)一步的研究和認(rèn)可，但膀胱癌細(xì)胞在治療過程中容易發(fā)生耐藥，嚴(yán)重影響患者預(yù)后。最新研究[11]表明，膀胱上皮癌干細(xì)胞暴露于吉西他濱和絲裂霉素中培養(yǎng)后，細(xì)胞自噬活性升高、糖酵解基因高表達(dá)、抑制自噬導(dǎo)致糖酵解基因表達(dá)降低，干細(xì)胞基因及耐藥基因的表達(dá)均降低，細(xì)胞凋亡數(shù)增加。這項(xiàng)研究表明，自噬與糖酵解可能在細(xì)胞耐藥性中發(fā)揮核心作用。

目前膀胱灌注的常用化療藥物有表柔比星、吡柔比星、絲裂霉素、阿霉素、羥基喜樹堿等。對于高危NMIBC，免疫增強(qiáng)劑BCG可通過誘導(dǎo)局部免疫反應(yīng)預(yù)防膀胱腫瘤的復(fù)發(fā)和進(jìn)展。臨床上，吉西他濱聯(lián)合順鉑治療晚期膀胱癌已經(jīng)成為膀胱癌治療的新標(biāo)準(zhǔn)。牛文杰等[12]的臨床研究證實(shí)這種新輔助化療能夠使浸潤性腫瘤直徑減小、分期降低。其安全性和耐受性較傳統(tǒng)的M-VAC方案更勝一籌。

在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中，增強(qiáng)的自噬水平既可為腫瘤細(xì)胞提供生存營養(yǎng)和轉(zhuǎn)移條件，也可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡。近年的研究將BCG通過誘導(dǎo)機(jī)體局部免疫反應(yīng)預(yù)防膀胱癌復(fù)發(fā)和進(jìn)展的非特異性作用稱為訓(xùn)練免疫，而細(xì)胞自噬是這種訓(xùn)練免疫信號誘導(dǎo)通路的主要參與者之一[13]。Huang等[14，15]通過實(shí)驗(yàn)得出結(jié)論，吉西他濱(GEM)在誘導(dǎo)人膀胱癌 T24細(xì)胞凋亡的同時(shí)還提高細(xì)胞自噬，抑制其自噬后 T24細(xì)胞對 GEM的化療敏感性即凋亡增加，順鉑誘導(dǎo)的膀胱癌細(xì)胞 T24自噬能夠促進(jìn)其誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過程，證明順鉑誘導(dǎo)的自噬對膀胱癌的治療起積極作用，這也進(jìn)一步解釋了新輔助化療吉西他濱+順鉑方案有效性的可能原因。最新研究[16]表明，傳統(tǒng)抗瘧藥氯喹能抑制膀胱癌 EJ和 T24細(xì)胞被輻射誘導(dǎo)的自噬，從而增加細(xì)胞的凋亡。

姜黃素(Cur)是從姜黃的根莖中提取的一種天然化合物，具有抗多種腫瘤的作用[17, 18]。Cur 還能夠增加吉西他濱等傳統(tǒng)化療藥物的療效。Cur能夠誘導(dǎo) T24 細(xì)胞發(fā)生自噬，試驗(yàn)[19]發(fā)現(xiàn)用3-MA 聯(lián)合 Cur預(yù)處理的T24細(xì)胞凋亡率顯著低于Cur單獨(dú)處理者，說明Cur誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬與其凋亡誘導(dǎo)效應(yīng)有關(guān)。Kang等[20]通過人膀胱癌細(xì)胞T24和J82的體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：阿伐他汀可通過促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡和誘導(dǎo)細(xì)胞自噬水平增加，進(jìn)一步降低T24、J82的細(xì)胞活性。自噬抑制劑可協(xié)同促進(jìn)阿伐他汀的促膀胱癌細(xì)胞凋亡作用。

檜木醇是一種從柏科植物中提取的天然化合物，Gao等[21]通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，自噬抑制劑3- MA可部分逆轉(zhuǎn)檜木醇對腫瘤細(xì)胞的作用，并通過比較檜木醇和3- MA聯(lián)合給藥及檜木醇單獨(dú)作用時(shí) LC3-Ⅱ的表達(dá)量得出結(jié)論，檜木醇激活的不適當(dāng)?shù)募?xì)胞自噬引起了膀胱癌J82細(xì)胞的凋亡。用葡萄籽提取物(GSE)處理膀胱癌T24和 HTB9細(xì)胞后，不僅癌細(xì)胞的生長出現(xiàn)抑制現(xiàn)象，而且細(xì)胞死亡數(shù)量增大[1]。研究者觀查到GSE處理后的癌細(xì)胞中出現(xiàn)胞質(zhì)空泡。進(jìn)一步分析證明這些胞質(zhì)空泡為自噬囊泡。他們在處理癌細(xì)胞的同時(shí)加入了自噬抑制劑后，癌細(xì)胞凋亡明顯增加，證明GSE誘導(dǎo)的自噬起到抑制癌細(xì)胞凋亡的作用。而上述觀察到的凋亡和自噬現(xiàn)象均由GSE介導(dǎo)的氧化應(yīng)激所觸發(fā)[22]。淫羊藿素是一種從淫羊藿屬植物中分離得到的黃酮醇苷，體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)盡管淫羊藿素對正常人胚腎293細(xì)胞的細(xì)胞毒性比較低，但它能明顯抑制人膀胱癌細(xì)胞BT5673和T24的增殖和聚集，通過線粒體膜電位的檢測發(fā)現(xiàn)細(xì)胞活性也被明顯抑制。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)淫羊藿素和表柔比星(EPI)聯(lián)合使用時(shí)，淫羊藿素通過抑制EPI誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬，增強(qiáng)了EPI對BT5673和T24細(xì)胞增殖的抑制效應(yīng)[23]。

紫檀芪是首先在紫檀種植物中發(fā)現(xiàn)的一種化學(xué)成分，對于多種癌癥、高血脂、高血壓都有一定的治療效果。研究[24]發(fā)現(xiàn)紫檀芪能夠通過引起細(xì)胞周期阻滯、誘導(dǎo)自噬和凋亡有效抑制敏感和耐藥人膀胱癌細(xì)胞的生長。粉防己堿(Tet)提取自植物粉防己的根塊，已有研究表明 Tet可逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞耐藥，增加腫瘤治療敏感性[25， 26]。Ni 等[27]通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)用Tet 處理過的膀胱癌 T24 細(xì)胞內(nèi)自噬泡的數(shù)量明顯增多，進(jìn)一步通過LC3 反轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Tet 通過阻斷自噬流下游引起自噬泡增多。

綜上所述，細(xì)胞自噬已成為潛在的攻克多種疾病的研究熱點(diǎn)之一。Beclin1的異常表達(dá)(甲基化、過表達(dá))可抑制膀胱癌細(xì)胞的增殖，細(xì)胞自噬水平增加可能通過抑制細(xì)胞內(nèi)源性凋亡抑制膀胱癌細(xì)胞凋亡。姜黃素、檜木醇、葡萄籽提取物、淫羊藿素、紫檀芪、粉防己堿等化合物均可通過抑制細(xì)胞自噬水平，進(jìn)一步促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞的凋亡。