張如意（通訊作者） 姚秀娟

（1浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院病理科 浙江 杭州 310009）

（2嘉興市第二醫(yī)院病理科 浙江 嘉興 314000）

結(jié)直腸癌是位居第3位的常見惡性腫瘤，其發(fā)病率逐年升高。結(jié)直腸癌至少起源于兩條不同的遺傳途徑。其中一條途徑與染色體不穩(wěn)定（CIN）有關(guān)，另一條與微衛(wèi)星不穩(wěn)定（microsatellite instability，MSI）有關(guān)[1]。MSI顯示出MMR缺失，故將其作為一種分子標(biāo)記。MMR起穩(wěn)定DNA的作用，在體細(xì)胞分裂時參與修復(fù)DNA復(fù)制過程中產(chǎn)生的特定復(fù)制錯誤。MSI腫瘤由于MMR缺陷，產(chǎn)生突變加速累積。結(jié)直腸癌中大約15%是由微衛(wèi)星不穩(wěn)定途徑形成的， DNA復(fù)制過程中錯配修復(fù)（mismatch repair，MMR）基因系統(tǒng)異常是MSI發(fā)生的原因[2]。MSI與DNA修復(fù)蛋白的表達(dá)減少有關(guān)，通常使用免疫組織化學(xué)檢測MLH1，MSH2，MSH6和PMS2作為MSI標(biāo)記。

在散發(fā)性結(jié)直腸癌中檢測MMR可作為HNPCC初篩，并且可對指導(dǎo)治療方案和預(yù)后方面具有重要意義。Dung T. Le等在2015年發(fā)現(xiàn)，傳統(tǒng)治療效果不理想的伴微衛(wèi)星不穩(wěn)定的結(jié)直腸癌晚期患者，在使用PD1抑制劑pembrolizumab時取得了驚人的效果，使得這類患者可接受腫瘤免疫治療，因此開展結(jié)直腸癌MMR檢測具有重要的臨床意義[3]。本研究采用免疫組織化學(xué)方法對90例連續(xù)的結(jié)直腸癌患者檢測MSH2、MSH6、MLH1和PMS2蛋白的表達(dá)，并觀察其臨床病理學(xué)意義。

1.材料和方法

1.1 材料

收集2016年—2017年嘉興市第二醫(yī)院病理科診斷為結(jié)直腸癌的病例90例。所有病例均經(jīng)兩位病理醫(yī)師復(fù)診。其中男性60例，女性30例，年齡30～88歲。左半結(jié)腸癌23例，右半結(jié)腸癌21例，直腸癌46例。71例高分化及中分化，19例低分化。浸潤深度17例未達(dá)漿膜，73例侵及漿膜。29例有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，61例無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。

1.2 方法

組織學(xué)和免疫組化染色：標(biāo)本均經(jīng)10%中性緩沖福爾馬林固定，常規(guī)脫水、石蠟包埋，連續(xù)切片，厚3～4μm，進(jìn)行常規(guī)HE及免疫組化EnVision兩步法染色，檢測MLH1、MSH2、MSH6和PMS2蛋白表達(dá)，所有抗體均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 結(jié)果判定

MMR蛋白定位于細(xì)胞核，細(xì)胞核著色判定為陽性，與染色強(qiáng)弱以及陽性細(xì)胞彌漫或局灶分布無關(guān)。細(xì)胞核不著色則判定為陰性。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，比較采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1 MLH1、MSH2、MSH6和PMS2免疫組織化學(xué)表達(dá)缺失

對90例結(jié)直腸癌樣本進(jìn)行MLH1、MSH2、MSH6、PMS2蛋白免疫組織化學(xué)檢測。MMR蛋白檢測可出現(xiàn)4種異常蛋白丟失表達(dá)方式，即MLH1-PMS2-、MSH2-MSH6-、MSH6-和PMS2-。本研究90例結(jié)直腸癌中，11例發(fā)生MMR蛋白丟失表達(dá)（圖1），其中8例MLH1-/PMS2-，1例MSH2-/MSH6-，2例PMS2-，以MLH1和PMS2蛋白表達(dá)缺失為主。MSH2、MSH6、MLH1、PMS2蛋白表達(dá)缺失率分別為1.1%（1/90）、1.1%（1/90）、8.9%（8/90）、11.1%（10/90）。

2.2 MLH1、MSH2、MSH6、PMS2蛋白表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床病理特征的相關(guān)分析（表1）

表1 MMR蛋白缺失表達(dá)與臨床病理因素分析

結(jié)直腸癌組織中MLH1、MSH2、MSH6、PMS2蛋白表達(dá)缺失與患者年齡、性別、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)（P＞0.05），缺失表達(dá)發(fā)生于右半結(jié)腸高于左半結(jié)腸和直腸（P=0.04），蛋白表達(dá)缺失與組織學(xué)分化高低相關(guān)（P=0.03）。

圖1 直腸癌組織HE染色及MMR蛋白的陽性表達(dá)（定位在細(xì)胞核）

3.討論

50～85%結(jié)直腸癌是由染色體不穩(wěn)定途徑發(fā)展而來，DNA錯配修復(fù)引起MSI約占10～20%[2]。將一個錯配修復(fù)基因如MLH1或MSH2敲除后導(dǎo)致遺傳突變，引起的HNPCC占CRC少于5%。MSI通常是由于MLH1啟動子散發(fā)性甲基化沉默引起[4]。本研究中dMMR在CRC中占12.2%（11/90），缺失表達(dá)發(fā)生于右半結(jié)腸高于左半結(jié)腸和直腸（P=0.04），蛋白表達(dá)缺失與組織學(xué)分化高低相關(guān)（P=0.03），這一數(shù)據(jù)與現(xiàn)有報道相比較一致。

本研究中不同MMR蛋白的缺失模式與其他報道相似，其中MLH1和PMS2最多，占的dMMR的72.7%。這一比率與其他報道相似。MLH1和PMS2同時缺失導(dǎo)致MLH1缺失突變和MLH1啟動子散在甲基化沉默，其他的dMMR蛋白缺失僅與各自的DNA修復(fù)基因突變有關(guān)。MMR翻譯時，有必要考慮MMR的二聚體關(guān)系。MSH2和MSH6結(jié)合形成MutSα異二聚體，識別并結(jié)合至錯配堿基對，并且引起MLH1和MSH2結(jié)合形成的MutLα異二聚體修復(fù)錯配堿基對。在MutLα和MutSα中，MLH1和MSH2是必須蛋白，而PMS2和MLH1是其相應(yīng)的結(jié)合配體蛋白。MLH1和MSH2是PMS2和MSH6穩(wěn)定所必須，MLH1或MSH2的缺失將引起其各自結(jié)合配體蛋白降解。相反，配體蛋白缺失并不影響必須蛋白，后者可與替代的次要蛋白結(jié)合成異二聚體[5]。因此，單獨(dú)缺失PMS2和MSH6最可能引起各自錯配基因的缺失突變。

2016年美國ASCO年會報告，腫瘤部位與Ⅲ∕Ⅳ期結(jié)直腸癌獨(dú)立的預(yù)后有關(guān)，右半結(jié)腸相較于左半結(jié)腸和直腸死亡風(fēng)險明顯增高。本研究結(jié)果顯示MLH1、MSH2、MSH6、PMS2蛋白表達(dá)缺失與患者年齡、性別、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)（P＞0.05），缺失表達(dá)發(fā)生于右半結(jié)腸高于左半結(jié)腸和直腸（P=0.04），也提示MMR蛋白表達(dá)狀態(tài)與結(jié)直腸癌預(yù)后相關(guān)。

MMR缺失患者對5-氟尿嘧啶的輔助治療效果不佳[6]。傳統(tǒng)治療效果不理想的伴微衛(wèi)星不穩(wěn)定的結(jié)直腸癌晚期患者，在使用PD1抑制劑pembrolizumab時取得了驚人的效果，使得這類患者可接受腫瘤免疫治療[3]。綜上所述，開展結(jié)直腸癌MMR檢測對于判斷預(yù)后及尋找有效治療方法，具有重要的臨床意義。