尹丹 曹穎 王禮鑫 馬亮，3 褚明亮 王劍 文建力 官志忠

1貴州醫(yī)科大學病理教研室（貴陽550004）；2貴州省人民醫(yī)院病理科（貴陽550002）；3貴州大學醫(yī)學院（貴陽550025）

胃癌是消化系統(tǒng)常見惡性腫瘤之一。Lauren分型是常用的胃癌組織病理學分型方法，將胃癌分為腸型、彌漫型、混合型和不確定型。我國胃癌高發(fā)并以腸型胃癌為主，因此研究腸型胃癌的發(fā)病機制對胃癌防治有著重要意義。

目前認為胃癌的發(fā)生、發(fā)展過程中，涉及多種促癌、抑癌基因的表達失調(diào)，最終導致各種蛋白產(chǎn)物的表達失衡［1］。酪蛋白激酶2 相互作用蛋白1（casein kinase 2 interaction protein 1，CKIP-1）是新近發(fā)現(xiàn)的一種調(diào)控蛋白。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，CKIP-1 可能作為一種抑癌基因參與了腸型胃癌的分化、浸潤及轉(zhuǎn)移［2］，但確切分子機制并不清楚。近年來，轉(zhuǎn)化生長因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）在胃癌的發(fā)生發(fā)展過程中的作用逐漸引起了學者的重視，胃癌細胞通過上調(diào)TGF-β1表達后促進了胃癌細胞浸潤及轉(zhuǎn)移［3-4］。近期有研究報道，CKIP-1 可能在TGF-β1通路中發(fā)揮負性調(diào)節(jié)作用，是TGF-β1的負性調(diào)節(jié)因子［5］，但腸型胃癌中CKIP-1 是否通過負性調(diào)節(jié)TGF-β1表達參與了癌細胞的惡性分化及浸潤轉(zhuǎn)移，未見相關(guān)研究報道。本研究通過觀察不同分化腸型胃癌細胞中CKIP-1 與TGF-β1表達及相關(guān)性，構(gòu)建過表達及干擾表達CKIP-1的人腸型腺癌MKN28細胞后檢測TGF-β1表達改變，初步探討腸型胃癌細胞中CKIP-1與TGF-β1表達的相關(guān)性及其在腸型胃癌惡性轉(zhuǎn)化中的可能作用。

1 材料與方法

1.1 細胞株 人腸型胃癌MKN28 細胞、SGC7901細胞、BGC823 細胞、MKN45 細胞、AGS 細胞及人腎細胞293T 分別購于湖南贏潤生物技術(shù)有限公司及中國科學院上海細胞生物研究所細胞庫。

1.2 主要試劑 兔抗CKIP-1 多克隆抗體、兔抗TGF-β1多克隆抗體及兔抗GAPDH 抗體購于Abcam公司；pLenti CMV Puro Empty 質(zhì)粒、pLKO.1-Puro 質(zhì)粒、pLenti CMV-no-target 質(zhì)粒及pLko.1-non-target 質(zhì)粒購于Addgene 公司；CKIP-1 質(zhì)粒、PMD2G 質(zhì)粒及PAPSX2 質(zhì)粒購于上海吉凱基因化學技術(shù)有限公司。

1.3 過表達及干擾表達CKIP-1 的人腸型腺癌MKN28 細胞模型構(gòu)建

1.3.1 過表達和干擾表達CKIP-1 的慢病毒載體構(gòu)建 構(gòu)建過表達CKIP-1 載體pLenti CMV-CKIP-1 和干擾表達CKIP-1 載體pLKO.1-CKIP-1，其中CKIP-1 過表達有效序列為5-ATGATGAAGAACAATTCCG-3（上游），5-TCACATCAGGCTCTTCCGGATC-3（下游）；CKIP-1 干擾表達有效序列為：5-CCGGCCTGAGTGACTATGAGAAGCTCGAGCTTCT -CATAGTCACTAAGGTTTTTG-3（上游），5-AATTCA AAAACCTGAGTGACTATGAGAAGCTCGAGCTTCTCATAGTCATCAGG-3（下游）。構(gòu)建成功后經(jīng)基因測序與比對分析基因序列與NCBI 公布的序列完全一致。

1.3.2 慢病毒包裝 將構(gòu)建好的質(zhì)粒、pLenti CMV-no-target 質(zhì)粒、pLko.1-non-target 質(zhì)粒、PMD2G 質(zhì)粒、PAPSX2 質(zhì)粒分別進行高純度無內(nèi)毒素抽提，測序成功后將目的質(zhì)粒與輔助包裝質(zhì)粒（PMD2G、PAPSX2）共轉(zhuǎn)染293T 細胞，6 h 后更換完全培養(yǎng)基，48 和72 h 分別收集細胞上清液置于-80 ℃冰箱保存。分別以pLenti CMV-no-target 空載組、pLko.1-non-target 空載組作為陰性對照組。

1.3.3 病毒感染細胞及穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株的篩選 取對數(shù)期人腸型胃癌MKN28 細胞接種于6 孔板中，鋪板過夜后更換培養(yǎng)基，分別加入適量病毒液及Polybrene（終濃度為6 μg/mL），72 h 后更換含有10 μg/mL 的嘌呤霉素的完全培養(yǎng)基進行嘌呤霉素抗性篩選，待細胞融合度達到80%左右進行后續(xù)實驗。

1.4 Real-time PCR 檢測 提取總RNA，然后逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA；按照RT-PCR 試劑盒說明書進行Real time PCR 擴增反應，反應體系均為20 μL。用于擴增CKIP-1 的引物序列5-AGGTTCAGGGACTGGGAGAT-3（上游），5-TCTGCAGGTCCATCTG TCTG-3（下游）。以β-actin 作為內(nèi)參基因，β-actin的引物序列5-TGGCACCCAGCACAATGAA-3（上游），5-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3（下游）。

1.5 Western blotting 檢測 收集細胞提取總蛋白并蛋白定量。經(jīng)10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)膜裝置將膠上的蛋白轉(zhuǎn)到PVDF 膜上。分別將PVDF 膜與一抗CKIP-1（1∶1 000）、TGF-β1（1∶500）及GAPDH（1∶20 000）4 ℃過夜，TBST 洗膜，二抗室溫孵育1 h，TBST 洗膜，ECL 化學發(fā)光法顯色、定影。用Labworks 軟件分析結(jié)果時以GAPDH蛋白條帶作為內(nèi)參照，計算CKIP-1、TGF-β1蛋白條帶與GAPDH 蛋白條帶像素灰度的百分比值作為CKIP-1、TGF-β1蛋白表達的相對水平。各組均設復孔3 個，重復實驗3 次。

1.6 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)以表示。組間比較采用單因素方差分析，后續(xù)組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，方差不齊時采用秩和檢驗。相關(guān)性分析采用Spearman 相關(guān)性分析，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 不同分化腸型胃癌細胞CKIP-1 與TGF-β1表達及相關(guān)性 與高分化胃癌MKN28 細胞相比，中分化SGC7901 細胞與低分化BGC823、MKN45及AGS 細胞CKIP-1 表達降低、TGF-β1表達升高（P＜0.01）；與中分化SGC7901 細胞相比，低分化BGC823、MKN45 及AGS 細 胞CKIP-1 表 達 降 低、TGF-β1表達升高（P＜0.01）。Spearman 相關(guān)性分析顯示，CKIP-1 與TGF-β1在不同分化腸型胃癌細胞中表達負相關(guān)（r＝-0.689 2，P＜0.01）。不同分化腸型胃癌細胞中CKIP-1 與TGF-β1表達及相關(guān)性見圖1。

2.2 過表達及干擾表達CKIP-1 的胃癌MKN28細胞模型鑒定 與空白對照組相比，過表達CKIP-1組mRNA 及CKIP-1 蛋白表達水平分別增加了282.53% 及256.16%（P＜0.01），干擾表達CKIP-1組CKIP-1 蛋白及mRNA 表達水平分別降低了64% 及72%（P＜0.01），陰性對照組與空白對照組CKIP-1 mRNA 及蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學意義，提示過表達及干擾表達CKIP-1 的胃癌MKN28細胞模型構(gòu)建成功。過表達及干擾表達CKIP-1的胃癌MKN28 細胞CKIP-1 mRNA 及蛋白表達見圖2。

2.3 過表達及干擾表達CKIP-1 的胃癌MKN28細胞TGF-β1的表達 與空白對照組相比，過表達CKIP-1 組MKN28 細胞TGF-β1表達水平下降（P＜0.01），干擾表達CKIP-1 組MKN28 細胞TGF-β1表達水平升高（P＜0.01），陰性對照組與空白對照組TGF-β1表達水平差異無統(tǒng)計學意義。過表達及干擾表達CKIP-1 的胃癌MKN28 細胞TGF-β1的表達見圖3。

3 討論

目前認為，腸型胃癌的發(fā)生可能是通過一系列胃黏膜前期病變，如慢性萎縮性胃炎、腸上皮化生、胃黏膜上皮異型增生所構(gòu)成的Correa 氏級聯(lián)反應發(fā)展而來［6］。CKIP-1 是酪蛋白激酶2（casein kinase 2，CK2）相互作用蛋白，其N-末端含有一個PH 結(jié)構(gòu)域，C-末端含有一個亮氨酸拉鏈基序的結(jié)構(gòu)域，這種特殊結(jié)構(gòu)使許多蛋白均可與CKIP-1發(fā)生相互作用，參與調(diào)控多條信號通路，在骨骼、腫瘤發(fā)生發(fā)展、肌肉細胞分化和免疫等方面發(fā)揮著重要的作用［7-11］。當前對CKIP-1在骨骼中的研究最為深入，CKIP-1 在成年骨形成過程中至關(guān)重要，已成為骨質(zhì)疏松癥治療最有希望的藥物靶點之一［9-10］。近年來研究顯示，CKIP-1 作為一種潛在的腫瘤抑制基因可能在大腸癌發(fā)生發(fā)展中起到重要作用［12-13］。由于胃黏膜腸化生上皮在組織學上與腸上皮非常相似，腸型胃癌常常發(fā)生于腸化生的基礎上，胃黏膜腸化生上皮向腸型胃癌轉(zhuǎn)變過程可能是否也存在類似的機制呢？為探討該問題，本課題組前期檢測了胃癌患者癌組織中CKIP-1 的表達［2］，發(fā)現(xiàn)與正常胃黏膜相比，胃腸化細胞CKIP-1蛋白表達顯著增高；而腸型胃癌細胞CKIP-1 表達又較胃腸化細胞CKIP-1 表達降低，并隨癌細胞分化程度下降、臨床分期越晚CKIP-1 表達則越低；干擾CKIP-1 表達后胃癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力增加，反之過表達CKIP-1 蛋白后胃癌細胞增殖、遷移和侵襲能力降低。上述結(jié)果提示，CKIP-1 可能作為一種抑癌基因參與了腸型胃癌的發(fā)生發(fā)展，但CKIP-1 通過調(diào)控哪些下游蛋白或信號通路參與腸型胃癌的發(fā)生發(fā)展卻并不清楚。

圖2 過表達及干擾表達CKIP-1 的胃癌MKN28 細胞CKIP-1 mRNA 及蛋白表達Fig.2 The expression of CKIP-1 mRNA and protein in MKN28 cell of gastric cancer with overexpression CKIP-1 and CKIP-1 shRNA

圖3 過表達及干擾表達CKIP-1 的MKN28 細胞TGF-β1的表達Fig.3 The expression of TGF-β1 protein in MKN28 cell of gastric cancer with overexpression CKIP-1 and CKIP-1 shRNA

TGF-β1是一種具有多種生物學活性的多肽類細胞因子［14］。近年來，人們逐漸認識到TGF-β1可能在胃癌的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移過程中起到重要作用。隨胃癌組織分化程度變低、臨床分期的進展以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的出現(xiàn)，TGF-β1表達逐漸增強［4，11，15］，通過刺激血管生成、細胞播散、免疫抑制及合成細胞外基質(zhì)等提供適宜腫瘤生長、浸潤及轉(zhuǎn)移的微環(huán)境促進胃癌細胞的生長浸潤及轉(zhuǎn)移［3］。近期有研究提示CKIP-1 可能在TGF-β1通路中發(fā)揮負性調(diào)節(jié)作用。CKIP-1 可上調(diào)泛素連接酶（smad ubiquitination regulatory factor 1，Smurf1）活性［7，13］。Smurf1 是第一個被發(fā)現(xiàn)的可以降解TGF-β1底物Smads 的細胞因子，推測CKIP-1 可能通過上調(diào)Smurf1 活性后降解Smads 蛋白，從而抑制TGF-β1的表達，在TGF-β1通路中發(fā)揮負性調(diào)節(jié)作用。另有研究對不同年齡SD 大鼠軟骨中CKIP-1 和TGF-β受體1 表達時發(fā)現(xiàn)，隨年齡增加CKIP-1 表達水平升高，而TGF-β 受體1 表達下降，提示CKIP-1 在關(guān)節(jié)軟骨增齡性變化中可能通過Smad7 的作用而降解了TGF-β受體1［5］。本課題組也發(fā)現(xiàn)過表達CKIP-1 的前列腺上皮BPH-1 細胞中TGF-β1表達下降（數(shù)據(jù)另文發(fā)表），也提示CKIP-1 可能在TGF-β1通路中發(fā)揮負性調(diào)節(jié)作用表達。

前期研究中筆者發(fā)現(xiàn)臨床胃癌患者癌組織和腸型胃癌細胞中CKIP-1 表達與分化浸潤轉(zhuǎn)移負相關(guān)，推測腸型胃癌組織惡性分化過程中癌細胞可能通過抑癌基因CKIP-1 表達下調(diào)，引起Smurf1合成減少及活性抑制，Smads 蛋白降解減少導致TGF-β1表達增加，加速了癌細胞的分化、浸潤轉(zhuǎn)移。為探討上述問題，本研究對不同分化的腸型胃癌細胞株CKIP-1 和TGF-β1的表達進行檢測并做了相關(guān)性分析。結(jié)果顯示，隨著胃癌細胞分化的逐漸降低，CKIP-1 表達逐漸下降，與前期本課題組對人胃癌組織中CKIP-1 表達免疫組化染色結(jié)果一致［2］。與高分化胃癌細胞相比，低分化胃癌細胞TGF-β1表達增加，與文獻報道一致［15］。相關(guān)性分析顯示不同分化腸型胃癌細胞中CKIP-1 與TGF-β 1表達負相關(guān)，提示隨著癌細胞分化降低，CKIP-1表達降低而TGF-β1表達增高。為進一步觀察腸型胃癌中CKIP-1、TGF-β1表達的關(guān)系，本研究分別構(gòu)建了過表達及干擾CKIP-1 表達的人腸型腺癌MKN28 細胞并檢測各組細胞TGF-β1表達變化。結(jié)果顯示，過表達CKIP-1 的MKN28 細胞TGF-β1表達降低，而干擾CKIP-1 表達的MKN28 細胞TGF-β1表達增加，上述結(jié)果提示CKIP-1 與TGF-β1蛋白表達負相關(guān)。

綜上，筆者認為在腸型胃癌細胞惡性分化進程中，可能通過抑癌基因CKIP-1 表達下降后上調(diào)TGF-β1的表達，促進了胃癌的惡性轉(zhuǎn)化及浸潤轉(zhuǎn)移，但具體信號通路尚需進一步深入研究，對CKIP-1 參與調(diào)控信號通路進一步深入研究將有助于了解腸型胃癌發(fā)病機制，并為CKIP-1 是否能作為胃癌可能分子治療靶點提供有用的實驗依據(jù)。