徐麗萍張蕾宋欣偉

1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院 杭州 310006 2.杭州市第七人民醫(yī)院

雷公藤（Tripterygium Wilfordii，TW）系衛(wèi)矛科雷公藤屬木質(zhì)藤本植物，具有強(qiáng)效的抗炎及免疫調(diào)節(jié)等作用，其有效活性提取物雷公藤多苷（Tripterygium glycosides，TG）已廣泛應(yīng)用于各種風(fēng)濕免疫性疾病的治療，因其療效確切而逐漸受到國(guó)際醫(yī)學(xué)同行的關(guān)注和認(rèn)可，但不良反應(yīng)在很大程度上限制了TG的臨床應(yīng)用。因此，如何在保證療效的前提下減低TG的不良反應(yīng)成了風(fēng)濕免疫性疾病研究的熱點(diǎn)。研究表明，TG不良反應(yīng)的產(chǎn)生與給藥劑量及給藥時(shí)間密切相關(guān)，且臨床多以肝功能損害、性腺抑制最為多見[1]。鑒于此，本課題組成員嘗試在保證療效的基礎(chǔ)上改進(jìn)給藥時(shí)間，以間歇給藥的方式替代連續(xù)給藥，同時(shí)摸索最佳的間歇給藥方案，以減少不良反應(yīng)。為了進(jìn)一步明確間歇給藥方案在減少藥物性肝功能損害和性腺抑制方面的優(yōu)勢(shì)，筆者在動(dòng)物試驗(yàn)中將間歇給藥方法與傳統(tǒng)的連續(xù)給藥方法進(jìn)行比較，觀察不同給藥方式對(duì)SD大鼠肝功能及生殖功能的影響。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 清潔級(jí)8周齡雌性SD大鼠60只，體質(zhì)量222～258g，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（浙）2018-0012]。所有大鼠均飼養(yǎng)于23～25℃的室內(nèi)，光照12h，標(biāo)準(zhǔn)飲食、自由飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)2～3d后用于實(shí)驗(yàn)。將所有大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為間歇給藥組、連續(xù)給藥組、空白對(duì)照組，每組各20只。

1.2 試劑與儀器 TG片由浙江省普洛康裕藥業(yè)有限公司生產(chǎn)（批號(hào)：Z33020778）。大鼠卵泡刺激素（follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH）ELISA 試劑盒、大鼠黃體生成素（luteinizing hormone，LH）ELISA試劑盒均購(gòu)于杭州達(dá)文生物工程公司（批號(hào)：YKE20084、YKE20085）。生化分析儀、標(biāo)準(zhǔn)規(guī)格酶標(biāo)儀均為美國(guó)GE公司產(chǎn)品。CL31R低溫高速離心機(jī)為Thermo Forma公司產(chǎn)品，以上儀器均由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 灌胃藥物制備及給藥 將TG片研末，以0.9%氯化鈉溶液配成濃度為2mg·mL-1的混懸液，給藥劑量根據(jù)魏偉等[2]主編的《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》中人與動(dòng)物按體表面積折算的等效劑量比值表計(jì)算。各組大鼠按以下方法灌胃：間歇給藥組以20mg/kg·d的TG灌胃給藥4d，其后3d改以等容量的0.9%氯化鈉溶液灌胃；連續(xù)給藥組以20mg/kg·d的TG每天灌胃給藥；空白對(duì)照組大鼠連續(xù)每天予等容量0.9%氯化鈉溶液灌胃。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)指標(biāo)檢測(cè) 間歇給藥組、連續(xù)給藥組大鼠藥物累積劑量達(dá)到800mg·kg-1時(shí)，各組分別隨機(jī)處死10只大鼠；藥物累積劑量達(dá)到1 400mg·kg-1時(shí)，各組分別處死余下大鼠，檢測(cè)以下指標(biāo)。

1.3.2.1 大鼠動(dòng)情周期觀察 處死大鼠前10d，每日上午9～11時(shí)行陰道細(xì)胞學(xué)涂片，以觀察給藥后大鼠動(dòng)情周期變化。以0.9%氯化鈉溶液浸濕的棉簽輕輕插入大鼠陰道內(nèi)，旋轉(zhuǎn)后取出棉簽并涂片，95%乙醇固定20min后巴氏染色，光鏡下觀察脫落細(xì)胞。動(dòng)情周期持續(xù)時(shí)間4～5d，根據(jù)脫落細(xì)胞的變化特點(diǎn)來劃分動(dòng)情周期的各階段[3]：動(dòng)情間期（65.72±10.69）h，陰道細(xì)胞學(xué)涂片以白細(xì)胞為主；動(dòng)情前期（18.45±2.14）h，涂片以有核上皮細(xì)胞為主；動(dòng)情期（12.24±3.36）h，以角化上皮細(xì)胞為主；動(dòng)情后期（14.12±3.78）h，涂片上兼見角化上皮細(xì)胞和白細(xì)胞[4]。陰道涂片細(xì)胞學(xué)無(wú)典型改變者即為動(dòng)情周期消失。

1.3.2.2 大鼠血清生化指標(biāo)檢測(cè) 大鼠以10%水合氯醛腹腔注射麻醉，腹主動(dòng)脈取血，室溫下放置1h，2 000r/min離心10min，分離血清后-4℃保存，擇期以ELISA法測(cè)定血清FSH與LH水平，生化分析儀檢測(cè)谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine transaminase，ALT）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate transaminase，AST）水平。

1.3.2.3 大鼠子宮、卵巢形態(tài)觀察 大鼠以10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，天平稱取體質(zhì)量。開腹取子宮和卵巢，以0.9%氯化鈉溶液沖洗，沖洗后用濾紙吸去多余水分，電子天平精確稱重后計(jì)算子宮、卵巢指數(shù)。卵巢指數(shù)=卵巢濕重（mg）/體質(zhì)量（g）×100%；子宮指數(shù)=子宮濕重（mg）/體重（g）×100%。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料組間比較采用卡方檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠肝功能比較 TG累積劑量達(dá)到800mg·kg-1時(shí)，間歇給藥組、連續(xù)給藥組大鼠ALT、AST水平均高于同時(shí)期空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），但兩給藥組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。當(dāng)累積劑量達(dá)1 400mg·kg-1時(shí)，間歇給藥組、連續(xù)給藥組SD大鼠的ALT、AST水平均較同時(shí)期空白對(duì)照組顯著升高（P＜0.01），而且間歇給藥組 ALT、AST 水平均低于連續(xù)給藥組（P＜0.05）。見表1。

2.2 TG對(duì)大鼠生殖功能的影響

表 1 各組大鼠肝功能比較（±s，U·L-1）Tab.1 Comparison of liver function in each group(±s,U·L-1)

表 1 各組大鼠肝功能比較（±s，U·L-1）Tab.1 Comparison of liver function in each group(±s,U·L-1)

注：與空白對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與連續(xù)給藥組比較，#P＜0.05Note:Compared with blank control group,*P＜0.05,**P＜0.01;compared with continuous administration group,#P＜0.05

組別 累積劑量（800mg·kg-1） 累積劑量（1 400mg·kg-1）AST ALT AST ALT間歇給藥組連續(xù)給藥組空白對(duì)照組129.80±31.72*131.40±26.45*45.00±10.90 30.10±5.89*32.30±5.08*22.50±3.59 147.20±15.47**#169.10±28.68**48.00±10.24 38.40±5.97**#45.70±4.11**24.30±3.10

2.2.1 各組大鼠動(dòng)情周期變化比較 TG累積劑量達(dá)到800mg·kg-1時(shí)，兩給藥組均有部分大鼠出現(xiàn)動(dòng)情周期延長(zhǎng)，與空白對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；間歇給藥組動(dòng)情周期延長(zhǎng)大鼠的比例低于連續(xù)給藥組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），但兩組均未出現(xiàn)動(dòng)情周期消失大鼠。累積劑量達(dá)到1 400mg·kg-1時(shí)，兩給藥組大鼠動(dòng)情周期均延長(zhǎng)，兩組均有部分大鼠動(dòng)情周期消失，與空白對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），間歇給藥組動(dòng)情延長(zhǎng)及動(dòng)情周期消失大鼠比例顯著低于連續(xù)給藥組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表 2。

2.2.2 各組大鼠卵巢、子宮指數(shù)比較 TG累積劑量達(dá)到800mg·kg-1時(shí)，間歇給藥組與連續(xù)給藥組大鼠卵巢、子宮指數(shù)均低于空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），但兩給藥組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。累積劑量達(dá)到 1 400mg·kg-1時(shí)，間歇給藥組與連續(xù)給藥組大鼠卵巢、子宮指數(shù)均明顯低于空白對(duì)照組（P＜0.01），而且間歇給藥組卵巢、子宮指數(shù)高于連續(xù)給藥組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見表3。

表2 各組大鼠動(dòng)情周期變化比較[n（%）]Tab.2 Comparison of estrous cycle changes in each group[n（%）]

2.2.3 各組大鼠生殖激素水平比較 TG累積劑量達(dá)到800mg·kg-1時(shí)，各組間FSH、LH水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；但間歇給藥組與連續(xù)給藥組FSH/LH值均高于空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），兩給藥組間比較，間歇給藥組性腺抑制情況較輕，F(xiàn)SH/LH值低于連續(xù)給藥組（P＜0.05）。累積劑量達(dá)到1 400mg·kg-1時(shí)，與空白對(duì)照組比較，間歇給藥組大鼠FSH、LH水平差異仍無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但以上兩組大鼠FSH、LH水平均低于連續(xù)給藥組（P＜0.05）；此時(shí)兩給藥組大鼠FSH/LH值均較前進(jìn)一步升高，均高于空白對(duì)照組（P＜0.05）；而間歇給藥組FSH/LH值仍低于連續(xù)給藥組（P＜0.01）。見表4。

表 3 各組大鼠卵巢、子宮指數(shù)比較（±s，mg·g-1）Tab.3 Comparison of ovarian and uterus indexes in each group(±s,mg·g-1)

表 3 各組大鼠卵巢、子宮指數(shù)比較（±s，mg·g-1）Tab.3 Comparison of ovarian and uterus indexes in each group(±s,mg·g-1)

注：與空白對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與連續(xù)給藥組比較，##P＜0.01Note:Compared with blank control group,*P＜0.05,**P＜0.01;compared with continuous administration group,##P＜0.01

組別 累積劑量（800mg·kg-1） 累積劑量（1 400mg·kg-1）卵巢指數(shù) 子宮指數(shù) 卵巢指數(shù) 子宮指數(shù)間歇給藥組連續(xù)給藥組空白對(duì)照組0.4080±0.039*0.3498±0.047*0.4475±0.055 1.2035±0.2408*1.0296±0.1342*1.4717±0.3141 0.4176±0.0510**##0.3753±0.0575**0.5066±0.0650 1.6060±0.4320**##1.1134±0.1760**1.7680±0.5463

表 4 各組大鼠 FSH、LH 水平比較（±s，mU·mL-1）Tab.4 Comparison of FSH and LH in each group(±s,mU·mL-1)

表 4 各組大鼠 FSH、LH 水平比較（±s，mU·mL-1）Tab.4 Comparison of FSH and LH in each group(±s,mU·mL-1)

注：與空白對(duì)照組比較，*P＜0.05；與連續(xù)給藥組比較，#P＜0.05，##P＜0.01Note:Compared with blank control group,*P＜0.05;compared with continuous administration group,#P＜0.05,##P＜0.01

組別 累積劑量（800mg·kg-1） 累積劑量（1 400mg·kg-1）FSH LH FSH/LH FSH LH FSH/LH間歇給藥組連續(xù)給藥組空白對(duì)照組1.12±0.18 1.15±0.11 1.01±0.28 2.77±0.13 2.84±0.22 2.76±0.12 0.39±0.02*#0.41±0.03*0.37±0.03 1.17±0.17#1.36±0.22 1.14±0.22#2.94±0.43#3.07±0.29 2.91±0.09#0.41±0.03*##0.44±0.06*0.38±0.04

3 討論

自20世紀(jì)60年代至今，研究證實(shí)TG能夠治療多種自身免疫性疾病，并具有起效快、療效好的特點(diǎn)，除了自身免疫性疾病外，TG還可用于皮膚病、血液病、腎臟病等疾病的治療，均有確切可觀的療效[5]。不僅如此，近年來TG逐漸引起了國(guó)外學(xué)者的注意。2009年Goldbach-Mansky等[6]報(bào)道了類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）的多中心隨機(jī)臨床試驗(yàn)結(jié)果，TG治療組患者的美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)（American College of Rheumatology，ACR）20%緩解率優(yōu)于柳氮磺吡啶組。2015年北京協(xié)和醫(yī)院張烜教授聯(lián)合國(guó)內(nèi)9家風(fēng)濕病研究中心的研究發(fā)現(xiàn)，在RA患者中單用TG的治療效果不亞于單用甲氨蝶呤，而且TG與甲氨蝶呤聯(lián)合使用的療效顯著優(yōu)于單用甲氨蝶呤[7-8]。其療效受到包括美國(guó)梅奧診所首席風(fēng)濕病學(xué)專家Mattson等諸多學(xué)者的高度重視，但其諸多不良反應(yīng)，如胃腸道反應(yīng)、肝酶升高、白細(xì)胞下降以及性腺損害（主要表現(xiàn)為月經(jīng)紊亂、精子減少）等，在很大程度上限制了TG的進(jìn)一步廣泛應(yīng)用。羅嵐等[9]研究揭示，TG的肝毒性作用主要表現(xiàn)在膽汁淤積、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)3個(gè)方面，并認(rèn)為這可能與其肝臟蓄積有關(guān)。

本課題組前期進(jìn)行了大量臨床觀察，發(fā)現(xiàn)臨床上采用TG間歇給藥方案治療RA有著不亞于連續(xù)給藥方案的療效，而且能一定程度地減少TG的不良反應(yīng)和耐藥的發(fā)生，但不同給藥方式對(duì)TG療效及不良反應(yīng)的影響目前尚無(wú)系統(tǒng)研究報(bào)道。而本課題組經(jīng)過長(zhǎng)期臨床研究發(fā)現(xiàn)，按照說明書建議的每日最大劑量（60mg/d，分3次給藥），每周用藥4d、停3d的間歇給藥方案能最大程度地保證療效，同時(shí)可以減少肝臟損害、性腺抑制的發(fā)生。本研究以等效劑量TG進(jìn)行了動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，證實(shí)當(dāng)累積劑量達(dá)到800mg·kg-1和1 400mg·kg-1時(shí)，間歇給藥方案能夠顯著降低藥物性肝臟損害以及性腺抑制的發(fā)生，但是否還有更佳的間歇給藥方案，目前正著手開展進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)及臨床研究。

目前，各類相關(guān)研究對(duì)提高TG療效及減少肝臟損害的內(nèi)容較多，而其對(duì)性腺損害的影響研究較少。本實(shí)驗(yàn)在研究間歇給藥方式對(duì)性腺損害的影響時(shí)，采用了目前公認(rèn)準(zhǔn)確可行的動(dòng)情周期、子宮及卵巢指數(shù)、性激素水平作為性腺功能的評(píng)判指標(biāo)。結(jié)果顯示，TG能使各組大鼠動(dòng)情周期紊亂，主要表現(xiàn)為動(dòng)情周期延長(zhǎng)；隨著劑量增加，連續(xù)給藥組部分大鼠動(dòng)情周期消失，比例高達(dá)60%。說明TG連續(xù)給藥對(duì)大鼠的動(dòng)情周期的影響更大，隨著累積劑量的增加，兩種不同給藥方式的影響差異更顯著。此外，本實(shí)驗(yàn)研究顯示同等劑量下，間歇給藥對(duì)子宮、卵巢發(fā)育的影響更小，可能與持續(xù)給藥更容易造成大鼠體內(nèi)生殖激素水平降低及失調(diào)有關(guān)，干擾卵泡發(fā)育成熟所需的激素微環(huán)境，從而影響子宮、卵巢的發(fā)育。臨床上可以配伍益腎填精類中藥，以減少TG長(zhǎng)期使用對(duì)性腺的損害，但通過間歇給藥方式來改善尚未見于報(bào)道，本研究結(jié)果為該給藥方案的可行性提供了一定的理論依據(jù)。

綜上所述，本研究證實(shí)同等劑量下，TG間歇給藥對(duì)動(dòng)物肝功能和性腺的影響小于連續(xù)給藥。但本研究設(shè)計(jì)較為簡(jiǎn)單，未深入研究相關(guān)機(jī)制，今后的研究將在評(píng)估療效的同時(shí)，進(jìn)一步對(duì)不同給藥方式的具體作用機(jī)制進(jìn)行探討。