袁育珺，楊秀玲，胡志堅(jiān)，汪 淵

腎小管上皮細(xì)胞生長(zhǎng)、移行在急性腎損傷修復(fù)，延緩糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)進(jìn)展等過(guò)程中起重要作用，尋找促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞增殖和遷移的因素或藥物十分重要。整合素(integrin)是一類(lèi)由α亞基和β亞基組成的異源二聚體跨膜蛋白，屬細(xì)胞黏附分子家族，研究[1]表明,其能介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)之間的黏附，是細(xì)胞遷移、增殖等生理活動(dòng)重要的調(diào)控因素。整合素α3和α6能與細(xì)胞外間質(zhì)中的層黏連蛋白(Laminin，LN)結(jié)合[2-3]，影響細(xì)胞的黏附和運(yùn)動(dòng)[4]。該研究采用體外培養(yǎng)HK-2細(xì)胞，運(yùn)用相關(guān)分子生物學(xué)技術(shù)(如酸性磷酸酶活性、細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)、免疫熒光、Western blot等)分析生長(zhǎng)于細(xì)胞外基質(zhì)上的HK-2細(xì)胞的增殖和遷移狀況以及整合素α3和α6蛋白表達(dá)的變化，并進(jìn)一步探討這些作用可能的分子調(diào)控機(jī)制，以開(kāi)拓其在臨床的應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1材料犬腎小管上皮細(xì)胞株MDCK和腎近曲小管上皮細(xì)胞株HK-2均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)生命科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)，于實(shí)驗(yàn)室液氮保存；DMEM和原裝小牛血清均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；酸性磷酸酶(acid phosphatase,ACP)活性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自安徽碧云天生物試劑公司；一抗actin、整合素α3和α6均購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；二抗購(gòu)自美國(guó)Pierce公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞外基質(zhì)的制備 液氮取出HK-2和MDCK細(xì)胞，迅速37 ℃循環(huán)水浴解凍，及時(shí)接種于含10%小牛血清DMEM，細(xì)胞培養(yǎng)箱(條件：37 ℃、5% CO2、飽和濕度)培養(yǎng)過(guò)夜。胰酶消化傳代，備用。細(xì)胞外基質(zhì)制備方法如下[5-6]：取MDCK細(xì)胞(細(xì)胞覆蓋率90%)，棄上清液，PBS清洗2遍，加入氨水(濃度為20 mmol/L)處理10 min，棄氨水，PBS清洗基質(zhì)3遍，在含或不含MDCK細(xì)胞外基質(zhì)上接種HK-2細(xì)胞，備用。分組為：正常對(duì)照組和細(xì)胞外基質(zhì)組。

1.2.2ACP活性檢測(cè)細(xì)胞增殖 按1.2.1事先在96孔板內(nèi)制備細(xì)胞外基質(zhì)，取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的HK-2細(xì)胞，胰酶消化，制成(1×102)～(1×105)/ml細(xì)胞懸液，平均接種于含或不含基質(zhì)的96孔板，分別設(shè)6復(fù)孔。連續(xù)培養(yǎng)48 h后，取出96孔板，棄上清液，PBS清洗2遍，按照ACP活性檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，第一步：加入底物，37 ℃孵育2 h；第二步：加終止液，室溫靜置20 min；第三步：酶標(biāo)儀檢測(cè)A405吸光度，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3細(xì)胞劃痕檢測(cè)細(xì)胞遷移 按1.2.1預(yù)先在6孔板內(nèi)制備細(xì)胞外基質(zhì)，取一瓶HK-2細(xì)胞(對(duì)數(shù)期生長(zhǎng))，棄上清液，PBS清洗2遍，胰酶消化，制成合適細(xì)胞懸液(5 000個(gè)/ml)，平均接種于含或不含基質(zhì)的6孔板。待各孔細(xì)胞覆蓋率90%，棄去上清液，PBS清洗2遍，用劃痕筆輕輕的在各孔正中央劃“十”字，PBS清洗3遍(盡量洗去殘留細(xì)胞)，加DMEM做好標(biāo)記并拍照。拍照分為0、24和48 h，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4免疫熒光 6孔板內(nèi)鋪上蓋玻片，事先在一半玻片上鋪細(xì)胞外基質(zhì)，再平均接種HK-2細(xì)胞。待細(xì)胞覆蓋率80%左右時(shí)，棄上清液，PBS清洗2遍，4%多聚甲醛固定20 min，PBS清洗3遍，5%脫脂奶粉封閉2 h，用鑷子小心取出玻片，置于載玻片上，PBS清洗3遍(每遍靜置10 min，盡量洗去殘留物)，加入鼠抗人α3多克隆抗體(1 ∶40稀釋于脫脂牛奶)，4 ℃孵育過(guò)夜；次日PBS清洗3遍，加入FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG(1 ∶100稀釋于PBS)，孵育2 h，PBS清洗3遍，加蓋玻片封片，經(jīng)復(fù)聚焦顯微鏡(confocalmicroscopy)雙光觀察，拍照備用，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3遍。

1.2.5Western blot 細(xì)胞總蛋白的提?。喊?.2.1分組，細(xì)胞培養(yǎng)瓶批量培養(yǎng)，48 h后，棄上清液， PBS清洗2遍(盡量去除殘留培養(yǎng)基，并控干)，按照本實(shí)驗(yàn)室蛋白提取指南[7]，方法：① 蛋白提取，培養(yǎng)瓶置冰上，每瓶加裂解液150 μl充分裂解，細(xì)胞刮子收集細(xì)胞，低溫冷凍離心，上清置于-80 ℃?zhèn)溆?；?BCA測(cè)定蛋白濃度，每組加入濃縮蛋白上樣緩沖液，水浴煮沸，分裝備用，置于-20 ℃保存；③ SDS-PAGE，配制12.5% SDS-PAGE，微量加樣針上樣，先用40～50 V電泳濃縮膠，100 V 電泳分離膠，100 mA冰浴轉(zhuǎn)膜，伊利脫脂牛奶封閉，PBS洗膜；④ 一抗結(jié)合，配置一抗?jié)舛葹橐种扑卅?(1 ∶400)、α6(1 ∶800)、actin(1 ∶1 000)，將膜置于一抗4 ℃過(guò)夜；⑤ 二抗結(jié)合，配置相應(yīng)二抗?jié)舛确謩e為1 ∶1 000、1 ∶1 500、1 ∶3 000，37 ℃孵育2 h，PBS洗膜3次；⑥ 暗室內(nèi)膠片顯影、定影，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果

2.1細(xì)胞外基質(zhì)對(duì)HK-2細(xì)胞體外增殖的影響ACP結(jié)果顯示：從表1可以看出隨著接種濃度的增加，無(wú)論含或不含基質(zhì)的HK-2細(xì)胞ACP活性也隨之增加；且細(xì)胞外基質(zhì)組ACP活性明顯高于正常對(duì)照組，結(jié)果表明細(xì)胞外基質(zhì)能促進(jìn)HK-2細(xì)胞體外增殖(圖1)。

表1 細(xì)胞外基質(zhì)對(duì)HK-2細(xì)胞體外增殖的影響

圖1 細(xì)胞外基質(zhì)對(duì)HK-2細(xì)胞體外增殖的影響

A：細(xì)胞濃度為1×102；B：細(xì)胞濃度為1×103；C：細(xì)胞濃度為1×104；D：細(xì)胞濃度為1×105；E：細(xì)胞濃度為1×106

2.2細(xì)胞外基質(zhì)對(duì)HK-2細(xì)胞遷移的影響細(xì)胞劃痕結(jié)果顯示：基質(zhì)能明顯增強(qiáng)HK-2細(xì)胞損傷愈合速度，由圖2可以看出，無(wú)論是24 h或者48 h，基質(zhì)組遷移距離都明顯高于正常對(duì)照組，結(jié)果表明細(xì)胞外基質(zhì)能促進(jìn)HK-2細(xì)胞遷移。見(jiàn)表2。

表2 細(xì)胞外基質(zhì)對(duì)HK-2細(xì)胞遷移的影響

圖2 細(xì)胞外基質(zhì)對(duì)HK-2細(xì)胞遷移的影響 ×100與正常對(duì)照組比較：*P<0.05

2.3細(xì)胞外基質(zhì)對(duì)整合素α3在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的影響免疫熒光結(jié)果顯示：正常對(duì)照組(圖3A)細(xì)胞周?chē)腥醯摹⒘闵⒌臒晒?，表明整合素?在正常HK-2細(xì)胞內(nèi)有表達(dá)；但是由圖3B可以看出，基質(zhì)組細(xì)胞周?chē)纤卅?呈片狀表達(dá)，而且熒光比較強(qiáng)。

圖3 細(xì)胞外基質(zhì)對(duì)整合素α3在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的影響 ×400

2.4細(xì)胞外基質(zhì)對(duì)整合素α3和α6蛋白表達(dá)的影響結(jié)果采用單因素方差分析進(jìn)行主體間效應(yīng)檢測(cè)(Fα3=39.54，F(xiàn)α6=57.31，P<0.01)。組間兩兩比較顯示：與正常對(duì)照組比較,整合素α3和α6蛋白表達(dá)明顯增加，見(jiàn)圖4。

3 討論

DN是常見(jiàn)的糖尿病并發(fā)癥，近些年的發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，已成為引起糖尿病患者死亡的主要原因。相關(guān)研究[8-9]指出在糖尿病腎病發(fā)生早期，腎小管上皮細(xì)胞的凋亡和氧化損傷是糖尿病并發(fā)癥的原始啟動(dòng)因子和細(xì)胞損傷的首要因素，也是腎小管間質(zhì)纖維化發(fā)生的關(guān)鍵環(huán)節(jié)；同樣，在缺血性急性腎損傷病理特征中，腎小管上皮細(xì)胞凋亡增加，是缺血性急性腎損傷的重要發(fā)病機(jī)制之一[10]。因此，尋找促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞增殖和遷移的因素或藥物來(lái)干預(yù)腎小管上皮細(xì)胞凋亡，維持上皮細(xì)胞活性，能有效地促進(jìn)急性腎損傷修復(fù)，并有望延緩糖尿病腎病進(jìn)展。

圖4 細(xì)胞外基質(zhì)對(duì)整合素α3和α6蛋白表達(dá)的影響與正常對(duì)照組比較：*P<0.05

MDCK細(xì)胞外基質(zhì)是犬腎小管上皮細(xì)胞基底膜成分，富含LN[11]。整合素是一類(lèi)由α亞基和β亞基組成的異源二聚體跨膜蛋白，屬細(xì)胞黏附分子家族，能介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)之間的黏附，是細(xì)胞遷移、增殖等生理活動(dòng)重要的調(diào)控因素[1]。每種亞單位包含胞外域、單跨膜和胞內(nèi)域。由外向內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo) (outside-insignaling)和由內(nèi)向外的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(inside-outsignaling)兩種途徑，由外向內(nèi)介導(dǎo)骨架重構(gòu)，由內(nèi)向外調(diào)節(jié)與配體的親和力[12]。因?yàn)槟軌蛟诩?xì)胞與細(xì)胞之間、細(xì)胞與胞外環(huán)境之間傳遞信息；從而對(duì)細(xì)胞的生存、增殖、黏附和遷移起到嚴(yán)格的控制[13]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：與正常對(duì)照組比較，MDCK細(xì)胞外基質(zhì)能明顯增加HK-2細(xì)胞的增殖和遷移，且整合素α3和α6的表達(dá)也呈上升趨勢(shì)。其機(jī)制可能為：整合素α3和α6屬層黏連蛋白受體，可以作為橋梁與細(xì)胞外間質(zhì)中的LN結(jié)合，調(diào)控多種細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路，包括肌動(dòng)蛋白(actin)成核、聚合的激活以及促活、促有絲分裂原信號(hào)等[14-15]，進(jìn)而促使培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行有絲分裂，影響HK-2細(xì)胞的黏附和運(yùn)動(dòng)。

但是細(xì)胞調(diào)控既復(fù)雜而嚴(yán)密，且細(xì)胞外基質(zhì)也是一個(gè)動(dòng)態(tài)且復(fù)雜的微環(huán)境，在不同的組織當(dāng)中呈現(xiàn)出不同的生物物理、機(jī)械性、生物化學(xué)方面的特征，所以MDCK細(xì)胞外基質(zhì)調(diào)控HK-2細(xì)胞增殖和遷移的機(jī)制并非如此的簡(jiǎn)單，如高表達(dá)的整合素α3和α6是通過(guò)哪些機(jī)制或信號(hào)通路來(lái)調(diào)控HK-2細(xì)胞的增殖和遷移尚不清楚，有待進(jìn)一步的研究和探討。