蘇麗艷

(西安文理學(xué)院 生物與環(huán)境工程學(xué)院，秦嶺野生觀賞植物研究中心, 陜西 西安 710065)

乙烯是一種小分子氣態(tài)植物激素，對(duì)果實(shí)成熟、種子萌發(fā)、葉和花衰老等多種植物發(fā)育過(guò)程有重要調(diào)控作用[1-2]。此外，乙烯在植物響應(yīng)生物和非生物脅迫過(guò)程中有重要的作用，當(dāng)植物體受到冷害、干旱、損傷、低氧等生物及非生物逆境脅迫時(shí)，其體內(nèi)乙烯的含量往往會(huì)增加[3]。乙烯信號(hào)通過(guò)相應(yīng)的轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑進(jìn)行脅迫信號(hào)的傳遞，調(diào)控下游基因的表達(dá)進(jìn)而使植物體在生理水平上發(fā)生一系列適應(yīng)環(huán)境的改變。乙烯受體 (Ethylene receptor, ETR) 蛋白是乙烯的負(fù)調(diào)控因子，是乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑上游重要組成元件之一，在缺乏乙烯時(shí)，受體會(huì)抑制乙烯誘導(dǎo)的相關(guān)基因表達(dá)；乙烯存在時(shí)，乙烯與受體蛋白結(jié)合使受體失活，從而激活下游的乙烯誘導(dǎo)相關(guān)基因[4-5]。

ETR家族包含多個(gè)同源基因，擬南芥中分離得到5個(gè)ETR受體基因，根據(jù)其結(jié)構(gòu)域可分為兩大亞家族，ETR1亞家族包括AtETR1和AtERS1，ETR2亞家族包括AtETR2、AtERS2、AtEIN3[6]。ETR1亞家族含有組蛋白激酶所需要的5個(gè)完整結(jié)構(gòu)域，而ETR2亞家族基因僅含有部分組蛋白激酶所需要的結(jié)構(gòu)域。番茄中分析篩選到6個(gè)乙烯受體，分別是：SlETR1、SlETR2、NR(Never-ripe)、SlETR4、SlETR5和SlETR6，它們?cè)诘鞍踪|(zhì)水平上差異較大,在序列上表現(xiàn)出50%以下的同源性[7-10]。目前已經(jīng)在鳳梨、蘋果、草莓、桃及芒果等多種植物中被分離出來(lái)[11-16]。

目前，對(duì)于乙烯受體ETR的研究多集中在其對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)控作用，如番茄乙烯受體SlETR1和SlETR2在乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起負(fù)調(diào)控作用[17-18]；NR突變體果實(shí)不能正常成熟[19]；SlETR4的存在可促使番茄果實(shí)乙烯響應(yīng)系統(tǒng)Ⅱ中乙烯的加速合成，促進(jìn)果實(shí)早熟[20-21]，果實(shí)成熟期時(shí)，SlETR5的表達(dá)明顯上升，而SlETR6的功能可能與SlETR4相似。目前，對(duì)于ETR在脅迫過(guò)程中的功能只有少量報(bào)道，前期研究發(fā)現(xiàn)，AtEIN2突變后影響擬南芥植株的鹽敏感度，證明AtEIN2參與鹽脅迫信號(hào)的調(diào)控過(guò)程[22]；可可CcEIN4抑制表達(dá)后可以提高植物對(duì)鹽脅迫的抗性，表明乙烯受體CcEIN4亦參與調(diào)控植株的鹽脅迫信號(hào)調(diào)控過(guò)程[23]。

番茄是研究呼吸躍變型果實(shí)發(fā)育特征的典型模式植物。SlETR6是番茄乙烯受體家族中發(fā)現(xiàn)較晚的一個(gè)成員，目前尚無(wú)SlETR6對(duì)干旱、高鹽、溫度脅迫響應(yīng)的相關(guān)報(bào)道。本研究對(duì)番茄矮化品種Mic-Tom中SlETR6基因進(jìn)行了克隆，并研究了SlETR6在不同植物組織及高鹽、高溫、低溫、干旱等脅迫條件下的表達(dá)模式，旨在為進(jìn)一步了解SlETR6在植物響應(yīng)環(huán)境脅迫中的功能奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料及脅迫處理

Mic-Tom番茄種子為中科院遺傳所饋贈(zèng)。種植于西安文理學(xué)院植物生長(zhǎng)繁育單元-西北文絡(luò)型連棟溫室中，番茄生長(zhǎng)條件：白晝溫度分別為光周期為16 h/8 h,晝夜溫度為27 ℃/19 ℃, 濕度為60%～80% RH。取番茄植株的不同植物組織，包括根、莖、葉、花、種子和不同發(fā)育時(shí)期果實(shí)(小果/花后5 d、中果/花后10 d、大果/花后25 d、轉(zhuǎn)色果/35 d、紅果/花后45 d)，取樣后立即用液氮凍存并存于-80 ℃冰箱備用。

選取盆栽長(zhǎng)勢(shì)一致的Mic-Tom番茄35 d苗植株進(jìn)行非生物脅迫處理，包括200 mmol/L NaCl溶液灌根、高溫(40 ℃)、低溫(4 ℃)、脫水即模擬干旱(將番茄苗洗凈根部泥土置于濾紙上)，以未做任何處理的植株為對(duì)照。每個(gè)處理3次重復(fù)，分別于處理后0，1，3，6，12，24 h收取葉片組織，液氮凍存后存于-80 ℃冰箱備用。

1.2 番茄總RNA提取及SlETR6基因的克隆

試驗(yàn)材料總RNA提取使用天根生化科技有限公司RNA提取試劑盒， 用1%瓊脂糖凝膠電泳測(cè)定其濃度和完整性，利用DNase去除基因組DNA后，利用TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒按照產(chǎn)品操作按說(shuō)明書合成cDNA。

以番茄葉片cDNA為模板進(jìn)行SlETR6基因ORF全長(zhǎng)克隆，利用Primer 5.0設(shè)計(jì)引物SlETR6-F：5′-GCAATGATGAAGAAAGTA-3′，SlETR6-R：5′-GTC ATGGCATTCCTCTG-3′。采用TaKaRa 公司的PrimeSTAR?HS DNA Polymerase高保真酶進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)體系為25 μL，反應(yīng)程序是：94 ℃，5 min；94 ℃，30 s，58 ℃，30 s，72 ℃，90 s，34個(gè)循環(huán)； 72 ℃，10 min。PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，將檢測(cè)到的目的片段用瓊脂糖凝膠純化回收，將回收到的目的基因產(chǎn)物連接到pMD19-T載體后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，篩選陽(yáng)性克隆提取質(zhì)粒后進(jìn)行DNA測(cè)序檢測(cè)。

1.3 番茄SlETR6基因的生物信息學(xué)分析

利用 DNAMAN 對(duì)SlETR6基因進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)；蛋白質(zhì)分子質(zhì)量和等電點(diǎn)預(yù)測(cè)利用在線軟件 ProtParam(http：//web. expasy.org/protparam/)計(jì)算完成；利用TargetP 1.1 Server、plantCARE 在線工具完成SLETR6蛋白的亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)、啟動(dòng)子順式作用元件分析。利用 MEGA 5 軟件構(gòu)建SlETR6基因系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.4 SlETR6表達(dá)特性分析

對(duì)番茄不同植物組織及不同脅迫處理得到的材料提取RNA, 純化后反轉(zhuǎn)錄為cDNA。在ABI Quant Studiotm6 Flex Real-time PCR 系統(tǒng)進(jìn)行qPCR 分析。以cDNA為模板，以SlUBI(GenBank登錄號(hào)：Q96483)為內(nèi)參。用 Primer 5.0 設(shè)計(jì)引物，qSlETR6-F：5′-GAATGGCATCCACGGAG-3′，qSlETR6-R: 5′-CAATCTCCTCAGTGTCG-3′；SlUBI-F: 5′-TGT CCCTATCTACGAGGGTTAT-3′；SlUBI-R：5′-AGTTAA ATCACGACCAGCAAGAT-3′。主要步驟按熒光定量試劑盒說(shuō)明書操作完成。反應(yīng)總體系為20 μL，10 μL 熒光染料反應(yīng)混合液，1 μL 模板cDNA (濃度 30 ng/μL)，引物各1 μL (10 μmol/L)，ddH2O 7 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃變性3 min；然后，95 ℃ 20 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共39次循環(huán)。qRT-PCR 反應(yīng)于ABI Quant Studiotm6 Flex Real-Time PCR System上進(jìn)行。相對(duì)表達(dá)量用2-ΔΔCT法分析[24]。

2 結(jié)果與分析

2.1 SlETR6基因的克隆和啟動(dòng)子序列分析

利用PCR方法克隆得到2 200 bp左右與預(yù)期大小一致的目標(biāo)片段(圖1)。測(cè)序結(jié)果表明，目標(biāo)條帶大小2 265 bp，與引物設(shè)計(jì)預(yù)測(cè)條帶一致，編碼754個(gè)氨基酸，其組成蛋白質(zhì)分子質(zhì)量為85.05 ku, 等電點(diǎn)為7.28。啟動(dòng)子序列分析表明，SlETR6含有TATA 框、CAAT 框等調(diào)控真核基因轉(zhuǎn)錄的基本元件外，還具有熱脅迫、干旱脅迫、低氧脅迫、光響應(yīng)、激素(乙烯、水楊酸、赤霉素)誘導(dǎo)響應(yīng)、防御與脅迫響應(yīng)元件等多種功能響應(yīng)元件(表1)。

2.2 SlETR6同源序列對(duì)比及進(jìn)化樹分析

利用BlastP對(duì)SlETR6基因編碼的氨基酸同源性進(jìn)行檢索，番茄SlETR6基因編碼的氨基酸與花生AiETR2蛋白(XP_016175314.1)、向日葵HaETR2-like蛋白(XP_022002894.1)、胡桃JrETR2-like蛋白(XP_018810721.1)、苦瓜McETR2蛋白(XP_022146885.1)、木薯MeETR2-like蛋白(XP_021607133.1)、煙草NaETR2-like蛋白(XP_019227687.1)、櫻桃PaETR2-like蛋白(XP_021807404.1)、矮牽牛PhETR蛋白(AAZ81985.1)、梅PmETR2(XP_008224393.1)、桃PpETR2蛋白(XP_007221962.1)、蓖麻RcETR2蛋白(XP_002529316.1)、芝麻SiETR2(XP_011091175.1)、馬鈴薯StETR-like蛋白(XP_006354517.1，)、棗ZjETR2蛋白(XP_015887972.1)等具有較高的相似性(圖2)。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明，其中番茄SlETR6與馬鈴薯StETR-like蛋白的同源性最高(圖3)。

M. Marker Ⅲ DNA 分子標(biāo)記；SlETR6. PCR 產(chǎn)物。M. Marker Ⅲ DNA Marker; SlETR6. PCR product.

表1 SlETR6啟動(dòng)子序列順式元件分析Tab.1 The analysis of putative cis-elements in the promoter of SlETR6 genes

圖2 番茄SlETR6與其他相似性高的氨基酸聚類分析Fig.2 Phylogenetic tree of amino acid sequences of SlETR6 of tomato and other similar amino acids

圖3 番茄SlETR6 與其他植物氨基酸序列的進(jìn)化樹分析Fig.3 Phylogenetic tree of SlETR6 and other plant species

2.3 SlETR6基因的組織表達(dá)分析

qPCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，SlETR6在番茄根、葉、花、果實(shí)中均有表達(dá)，其在花中相對(duì)表達(dá)量較高，在葉中最低，在花、紅果和葉片中的表達(dá)量與種子相比存在顯著差異(圖4-A)；對(duì)SlETR6在果實(shí)不同發(fā)育時(shí)期的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)色果中表達(dá)量最高，紅果和大果次之，在轉(zhuǎn)色果、紅果和大果中的表達(dá)量與小果相比存在顯著性差異(圖4-B)。

A.不同植物組織中SlETR6基因的表達(dá)情況；B.果實(shí)發(fā)育不同時(shí)期SlETR6基因的表達(dá)情況。不同小寫字母表示在0.05水平差異顯著。圖5-7同。A. Relative expression of SlETR6 in different tissues; B. Relative expression of SlETR6 at different stage of fruit development. Different small letters show significantly different at 0.05.The same as Fig.5-7.

2.4 SlETR6基因在高鹽脅迫下的表達(dá)分析

為了解SlETR6基因?qū)Ω啕}響應(yīng)的表達(dá)特征，利用qPCR檢測(cè)了其在脅迫后不同時(shí)間段的表達(dá)情況。結(jié)果顯示：高鹽脅迫處理6，12 h后SlETR6相對(duì)表達(dá)量具有顯著性提高，且在處理后12 h表達(dá)量達(dá)到最高，相對(duì)表達(dá)量約為對(duì)照組的3.6倍，損傷處理24 h后SlETR6基因的相對(duì)表達(dá)量恢復(fù)正常水平(圖5)。

2.5 SlETR6基因在溫度脅迫下的表達(dá)分析

如圖6所示，高溫 (40 ℃) 儲(chǔ)藏后SlETR6基因表達(dá)量表現(xiàn)出先升高(1～3 h)后下降(6～12 h)的趨勢(shì)，并在高溫處理3 h后達(dá)到峰值。高溫脅迫24 h后其相對(duì)表達(dá)量恢復(fù)正常水平。低溫4 ℃脅迫處理后，SlETR6基因相對(duì)表達(dá)量在低溫處理后1，6，12，24 h表現(xiàn)出下調(diào)趨勢(shì)。

圖5 高鹽脅迫下SlETR6基因的表達(dá)情況Fig.5 Relative expression of SlETR6 under high salt stress

圖6 溫度脅迫下SlETR6基因的表達(dá)情況Fig.6 Relative expression of SlETR6 under temperature stress

2.6 SlETR6基因在干旱脅迫下的表達(dá)分析

在干旱脅迫條件下，SlETR6基因脅迫處理1 h后迅速應(yīng)答，與對(duì)照組相比，其相對(duì)表達(dá)量提高1倍，3 h后其表達(dá)量呈下降趨勢(shì)，但仍高于同期對(duì)照組。干旱脅迫處理24 h后，SlETR6基因的相對(duì)表達(dá)量恢復(fù)正常水平(圖7)。與同期對(duì)照組相比，SlETR6基因在干旱脅迫的初期(1，3，6 h)均表現(xiàn)出顯著性上調(diào)表達(dá)。

圖7 干旱脅迫下SlETR6基因的表達(dá)情況Fig.7 Relative expression of SlETR6 under drought stress

3 結(jié)論與討論

植物抗逆效應(yīng)是植物對(duì)抗不良環(huán)境，比如抗旱、抗鹽堿、抗?jié)场⒖癸L(fēng)、抗凍、抗病蟲害等的能力。逆境的種類多種多樣，主要可分為生物逆境和非生物逆境兩大類。研究植物在非生物脅迫條件下的調(diào)節(jié)機(jī)制，對(duì)通過(guò)植物育種改變作物的特性、培育抗逆新品種有重要的意義。乙烯在響應(yīng)植物逆境脅迫過(guò)程中有重要的作用[25-29]，而對(duì)于乙烯受體在響應(yīng)非生物脅迫過(guò)程中的研究較少，SlETR6是番茄乙烯受體家族成員之一，目前，尚無(wú)SlETR6參與非生物脅迫應(yīng)答中的功能研究相關(guān)報(bào)道。

本研究在番茄中克隆了乙烯受體家族成員之一SlETR6，含有2 265 bp的開放讀碼框，編碼754個(gè)氨基酸。乙烯受體是乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的負(fù)調(diào)控因子，參與了植物生長(zhǎng)發(fā)育的多個(gè)過(guò)程。序列分析及同源性比對(duì)分析表明，SlETR6與馬鈴薯ETR-like蛋白的同源性最高。啟動(dòng)子序列分析表明，SlETR6具有多種逆境響應(yīng)功能元件，如熱脅迫、干旱脅迫、低氧脅迫、光響應(yīng)、激素(乙烯、水楊酸、赤霉素)誘導(dǎo)響應(yīng)、防御與脅迫響應(yīng)元件等。

通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析了SlETR6基因在種子、根、葉、花、花后5，10，15，25，35(綠熟期果實(shí))，45 d(紅熟期果實(shí))等不同組織中的相對(duì)表達(dá)量，SlETR6在番茄的不同組織中均有表達(dá)，且在花和轉(zhuǎn)色期果實(shí)中表達(dá)量較高，推測(cè)SlETR6可能對(duì)于花的發(fā)育及果實(shí)的成熟過(guò)程有一定的調(diào)控作用。

另外，SlETR6對(duì)不同脅迫的響應(yīng)模式不同。在4，40 ℃ 2個(gè)溫度逆境脅迫環(huán)境下，SlETR6受到高溫脅迫后強(qiáng)烈誘導(dǎo)，且在處理后3 h左右達(dá)到峰值，隨后表達(dá)水平小幅下調(diào)，但仍然顯著高于對(duì)照組，在處理后24 h恢復(fù)正常水平；高鹽脅迫下，SlETR6在處理6 h后被誘導(dǎo)呈上調(diào)表達(dá)，并在處理后12 h達(dá)到峰值，為對(duì)照組的3.6倍；SlETR6在干旱脅迫早期受到強(qiáng)烈誘導(dǎo)，在處理后1 h達(dá)到峰值，是對(duì)照組的2倍。qPCR結(jié)果表明SlETR6同時(shí)受到高鹽、高溫、干旱等脅迫條件誘導(dǎo)，且生物信息學(xué)分析表明SlETR6基因啟動(dòng)子序列含有大量脅迫應(yīng)答元件，包括干旱、熱、防御反應(yīng)相關(guān)的元件。綜上，推測(cè)SlETR6基因在響應(yīng)脅迫應(yīng)答中發(fā)揮重要調(diào)控作用。本研究為后續(xù)研究SlETR6在響應(yīng)逆境脅迫過(guò)程中的功能及作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)，為將來(lái)利用分子育種手段培育番茄抗逆新品種提供重要的基因資源。