郭琳琳，羅 靜，龐榮麗，王瑞萍，黃玉南，喬成奎，李 君，龐 濤，謝漢忠

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 鄭州果樹研究所，河南 鄭州 450009)

我國獼猴桃資源豐富，自然分布有52個種。獼猴桃果實(shí)維生素C含量較高，且富含多種礦物質(zhì)和膳食纖維，具有極高的營養(yǎng)和保健價(jià)值，被譽(yù)為“水果之王”。獼猴桃是典型的呼吸躍變型果實(shí)，需經(jīng)過貯藏使其完成后熟過程，因此，貯藏能力是影響其商品價(jià)值的重要因素之一。影響獼猴桃貯藏品質(zhì)的因素除了低溫、氣調(diào)貯藏、冷鏈運(yùn)輸?shù)炔珊蟓h(huán)節(jié)外，最主要的影響因素是采前環(huán)節(jié)，包括品種、砧木等遺傳因素、氣候條件、栽培管理水平、病蟲害發(fā)生情況等，而CPPU(N-(2-氯-4-吡啶基)-N-苯基脲)的施用與否也與其貯藏品質(zhì)有關(guān)[1-2]。

CPPU是一種具細(xì)胞分裂素活性的植物生長調(diào)節(jié)劑，能顯著促進(jìn)細(xì)胞分裂和增長，在葡萄、草莓、西瓜、梨等果品生產(chǎn)中使用普遍，表現(xiàn)出極大的促進(jìn)果實(shí)生長、增加單果質(zhì)量的作用[3]。隨著CPPU施用的普及，研究者發(fā)現(xiàn)它還能影響果實(shí)在成熟時(shí)的營養(yǎng)成分，如果實(shí)的糖、酸等含量[4-6]。在獼猴桃果實(shí)的應(yīng)用中，CPPU能改善果實(shí)碳水化合物的代謝，增加生長期可溶性糖和淀粉從而改善果實(shí)品質(zhì)[7]；花后噴施5 mg/L CPPU使獼猴桃果實(shí)單果質(zhì)量增加的同時(shí)，還能增加果實(shí)可溶性固形物和總糖的含量，而20 mg/L CPPU處理雖能較好地增加果實(shí)單果質(zhì)量，但果實(shí)風(fēng)味品質(zhì)變差[8-9]。也有研究者認(rèn)為，在獼猴桃上施用CPPU能同時(shí)顯著降低可溶性固形物和可滴定酸的含量[10]。但目前關(guān)于 CPPU 處理影響獼猴桃采后貯藏期間糖含量的機(jī)理尚未得到闡釋。為了探究CPPU處理對獼猴桃果實(shí)品質(zhì)影響的分子機(jī)制，本研究在盛花后20 d，采用20 mg/L的CPPU處理徐香獼猴桃(Actinidiadeliciosacv. Xuxiang)，成熟后采集果實(shí)并在常溫條件下貯藏2，4，6，8 d，分別測定果實(shí)的糖、酸及轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，對轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果進(jìn)行組裝和注釋，并鑒定與糖含量變化相關(guān)的候選基因。旨在為鑒定獼猴桃果實(shí)貯藏過程相關(guān)的基因提供有用資源，并為探究通過分子手段抑制CPPU處理果實(shí)品質(zhì)下降的可行性提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)于2016年4月在獼猴桃主產(chǎn)區(qū)河南省西峽縣商品果園內(nèi)進(jìn)行，以清水為對照，用20 mg/L的CPPU處理徐香獼猴桃幼果。9月，采摘成熟、大小一致、無病蟲害的獼猴桃果實(shí)，迅速運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室，置于溫度25 ℃、濕度60%左右的條件下常溫貯藏。分別于采后2，4，6，8 d取6～8個果實(shí)，去皮，取果肉混合至液氮冷凍后-80 ℃保存，供糖、酸含量測定及RNA提取。

1.2 測定項(xiàng)目及方法

1.2.1 可溶性固形物的測定 參照農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)(NY/T 2637-2014)《水果和蔬菜可溶性固形物含量的測定折射儀法》[11]。

1.2.2 可溶性總糖的測定 采用菲林試劑滴定法。果肉勻漿后稱取20 g，用水洗入250 mL的容量瓶中，加鹽酸3.5 mL，放入80 ℃水浴中15 min，冷卻后調(diào)pH值至中性，定容至250 mL，過濾液即為總糖提取液，用菲林試劑測定總糖含量(以葡萄糖計(jì))。

1.2.3 可滴定酸含量的測定 參照國標(biāo)(GB/T 12456-2008)《食品中總酸的測定》[12]。

1.3 轉(zhuǎn)錄組測序

利用多糖多酚植物RNA提取試劑盒(北京華越洋生物科技有限公司)提取果肉RNA，加DNaseⅠ(TaKaRa)去除DNA，利用瓊脂糖電泳檢測RNA的純度后，利用Ist Strand cDNA Synthesis Kit(TaKaRa)對RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

利用單鏈cDNA、dNTPs、RNase H和DNA 聚合酶Ⅰ合成雙鏈cDNA，之后添加接頭，純化并構(gòu)建測序文庫，在北京百邁客生物科技有限公司的HiSeq 2500(Illumina，San Diego，CA，USA)上進(jìn)行測序。測序結(jié)果去除接頭和低質(zhì)量序列，利用TopHat 2[13]軟件將序列比對至參考基因組[14]，基因表達(dá)量的計(jì)算采用FPKM(Fragments per kb per million reads)值表示。

1.4 目標(biāo)基因的GO注釋和KEGG分析

GO(Gene Ontology)注釋采用Blast2GO軟件[15]，KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)采用NCBI的Blastall程序進(jìn)行通路分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 獼猴桃貯藏過程中糖、酸含量的變化

貯藏過程中，獼猴桃果實(shí)可溶性固形物、可滴定酸和可溶性糖含量的變化情況如圖1所示。

從圖1可以看出，獼猴桃果實(shí)在常溫貯藏過程中，對照和CPPU處理果實(shí)的可溶性固形物和可溶性糖含量變化與貯藏天數(shù)成正比，可滴定酸含量變化趨勢相反。對照的果實(shí)可溶性固形物比同時(shí)期CPPU處理明顯提高，貯藏第4天時(shí)提高比例最高，達(dá)20%，其次是貯藏第6天，提高比例為17%，且差異顯著(P<0.05)。對照的果實(shí)可溶性糖含量高于同期CPPU的處理，貯藏第6天時(shí)二者差異顯著(P<0.05)。而對照和CPPU處理的可滴定酸含量隨貯藏時(shí)間的變化差異不顯著(P>0.05)，可見，可溶性糖含量的增加是可溶性固形物含量上升的主要原因。結(jié)果表明，施用CPPU降低了獼猴桃果實(shí)可溶性固形物和可溶性糖的含量。

圖中不同小寫字母表示不同處理間差異顯著(P<0.05)。圖4同。Different lowercase letters in the figure indicate significant differences of different treatments(P<0.05).The same as Fig.4.

2.2 糖代謝相關(guān)基因的篩選

轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果參考Luo等[16]，即8個文庫共得到56.68 Gb的序列。根據(jù)可溶性固形物含量的變化，CPPU處理果實(shí)中共篩選出2 009個上調(diào)表達(dá)的基因，對照果實(shí)中有1 761個上調(diào)表達(dá)的基因，二者均為上調(diào)的基因有580個。

2.3 糖代謝相關(guān)基因的GO富集

對2.2中580個均為上調(diào)的基因進(jìn)行GO富集分析，如圖2。對注釋基因的功能進(jìn)行歸類，即生物過程、細(xì)胞構(gòu)成和分子作用，再細(xì)化為53個二級功能。在生物過程中，細(xì)胞過程和單細(xì)胞生物過程基因數(shù)量較多；在細(xì)胞構(gòu)成中，細(xì)胞部分和細(xì)胞基因數(shù)量較多；在分子作用中，約束和催化活性基因數(shù)量較多。

圖2 篩選基因的GO注釋Fig.2 GO annotation of screening gene

2.4 糖代謝相關(guān)基因的KEGG注釋

KEGG的Pathway分析如圖3。

在代謝中，基因數(shù)目最多的為氨基糖和核苷酸糖代謝途徑，其次為氧化磷酸化、糖酵解、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白加工代謝途徑，另外還有丙酮酸、氮、脂肪酸等代謝途徑，其中的脂肪酸、醚、丙酮酸、苯丙氨酸、萜類可能與獼猴桃后熟過程中的香氣成分代謝有關(guān)[16]。

2.5 糖代謝相關(guān)基因的表達(dá)分析

根據(jù)KEGG注釋結(jié)果，有2個基因(Achn069851和Achn203191)涉及果糖和甘露糖代謝、3個基因(Achn161931、Achn199771和Achn295291)涉及戊糖和葡萄糖醛酸酯的轉(zhuǎn)化、7個基因(Achn019911、Achn069851、Achn087691、Achn161931、Achn206141、Achn270701和Achn295291)涉及淀粉和蔗糖代謝，這些基因可能與糖含量的上升有關(guān)。去除冗余基因后，剩余基因8個，其表達(dá)如圖4。

圖3 篩選基因的KEGG注釋Fig.3 KEGG annotation of screening gene

圖4 糖含量相關(guān)基因在貯藏過程中的表達(dá)變化Fig.4 Expression changes of sugar-related genes during storage

在上述8個基因中，整體表達(dá)量從高到低排列依次為基因Achn270701被注釋為葡萄糖-1-磷酸腺苷轉(zhuǎn)移酶(APS2)，基因Achn295291被注釋為編碼果膠甲酯酶(PME)，基因Achn203191 被注釋為編碼磷酸丙糖異構(gòu)酶(TPI)，基因Achn161931被注釋為編碼尿苷二磷酸葡萄糖脫氫酶(UGD)，基因Achn087691被注釋為編碼磷酸己糖異構(gòu)酶(GPI)，基因Achn069851被注釋為編碼己糖激酶(HXK)，基因Achn206141被注釋為編碼尿苷二磷酸-葡萄糖醛酸酯-4-表異構(gòu)酶(GAE)，基因Achn019911 被注釋為葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶(GAUT3)?？梢钥闯?，基因Achn270701在貯藏期間表達(dá)量整體高于其他基因，基因Achn019911在貯藏期間表達(dá)量整體較低。基因Achn019911、Achn069851、Achn087691和Achn203191從貯藏第2天到第8天的表達(dá)量上升緩慢，上升倍數(shù)小于1.5，而基因Achn161931、Achn206141和Achn295291在從第2～8天的表達(dá)量上升3倍以上。對照與CPPU處理基因Achn011911、Achn087691、Achn203191的相對表達(dá)量變化趨勢基本一致，且對照整體高于CPPU處理；基因Achn069851、Achn161931和Achn206141的相對表達(dá)量的均呈現(xiàn)對照比CPPU處理高-低-高的變化趨勢?；駻chn295291和Achn161931的相對表達(dá)量在對照和CPPU處理間差異較大，其中，在貯藏第2天對照基因Achn161931的表達(dá)量高于CPPU處理，貯藏第4天CPPU處理的表達(dá)量明顯高于對照，貯藏第6，8天對照又高于CPPU處理，對照基因Achn295291在貯藏第2，4天幾乎沒有表達(dá)，而在貯藏第6天以后表達(dá)量明顯高于CPPU處理。

3 結(jié)論與討論

獼猴桃發(fā)育過程糖積累為淀粉轉(zhuǎn)化型，即葉片光合產(chǎn)物輸入果實(shí)后，除用果實(shí)生長發(fā)育與呼吸消耗外，多余部分主要以淀粉形式積累于果實(shí)中直至采收，采收后的果實(shí)經(jīng)后熟將淀粉轉(zhuǎn)化為可溶性糖。Cruz-Castillo 等[17]認(rèn)為，施用CPPU影響海沃德獼猴桃果實(shí)發(fā)育過程中糖組分、可滴定酸的含量，成熟后對照果實(shí)糖酸含量明顯高于處理果。本研究表明，0 mg/L處理的獼猴桃果實(shí)在常溫貯藏軟化過程中可溶性固形物和糖含量較同時(shí)期20 mg/L處理的果實(shí)增高明顯，與上述研究結(jié)果吻合。

潘儼等[18]研究表明，代謝強(qiáng)度較高的糖酵解途徑(EMP)與蔗糖/淀粉代謝關(guān)聯(lián)，是促進(jìn)香梨果心和果肉糖代謝、單糖持續(xù)積累的有利條件。磷酸己糖異構(gòu)酶和磷酸丙糖異構(gòu)酶，二者是EPM關(guān)鍵酶，在常溫貯藏軟化過程中，處理果基因Achn087691(編碼磷酸己糖異構(gòu)酶)和基因Achn203191(編碼磷酸己糖異構(gòu)酶)的表達(dá)量均低于對照果實(shí)，說明這2個基因與處理果實(shí)糖含量降低有密切關(guān)系。

己糖激酶參與催化己糖進(jìn)入糖酵解的第一步不可逆反應(yīng)，既能催化果糖的磷酸化又能催化葡萄糖的磷酸化。秦巧平等[19]研究表明，在溫州蜜柑果實(shí)發(fā)育過程中，可食部分果糖激酶活性逐漸降低，糖含量不斷增加，成熟期果皮蔗糖和葡萄糖含量略有下降，果糖激酶活性卻略有升高。本研究獼猴桃常溫貯藏過程中，對照和CPPU處理果實(shí)的基因Achn069851(編碼己糖激酶)表達(dá)均呈上升趨勢，CPPU處理果實(shí)從第2天到第4天表達(dá)量升高明顯高于對照，由此可見，CPPU處理后的獼猴桃果實(shí)在貯藏期糖酵解反應(yīng)增強(qiáng)，己糖代謝量增加，是致使果實(shí)糖含量低于對照的可能原因。

尿苷二磷酸葡萄糖脫氫酶(UGD)催化UDP-葡萄糖氧化生成UDP-葡萄糖醛酸酯，之后轉(zhuǎn)化生成半乳糖醛酸、木糖、阿拉伯糖、芹菜糖等糖類，這些糖類是植物細(xì)胞壁中半纖維素和果膠等物質(zhì)合成的前體；尿苷二磷酸葡萄糖脫氫酶、尿苷二磷酸-葡萄糖醛酸酯-4-表異構(gòu)酶(GAE)和果膠甲酯酶(PME)與果實(shí)軟化有密切的關(guān)系[20-22]，本研究中，不同處理果實(shí)的基因Achn161931(編碼尿苷二磷酸葡萄糖脫氫酶)、基因Achn206141(編碼尿苷二磷酸-葡萄糖醛酸酯-4-表異構(gòu)酶)、基因Achn295291(編碼果膠甲酯酶)在貯藏過程中均有相同的變化趨勢，CPPU處理果實(shí)第4天的表達(dá)量高于對照，第6天和第8天的表達(dá)量低于對照，由此推測，CPPU使果實(shí)提前軟化，這與龐榮等[23]在6種獼猴桃果實(shí)的研究結(jié)果相似，并且CPPU抑制了獼猴桃貯藏后期與軟化相關(guān)的酶的表達(dá)。

綜上所述，20 mg/L CPPU處理明顯影響了徐香獼猴桃果實(shí)中可溶性糖含量與相關(guān)基因的表達(dá)，致使果實(shí)常溫貯藏過程中可溶性固形物和可溶性糖含量降低，并且提前軟化。