姜 琪，陳志偉，劉成洪，何 婷，郭桂梅，高潤紅，徐紅衛(wèi)，李穎波，陸瑞菊，黃劍華

(1. 上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306；2. 上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院 生物技術(shù)研究所，上海 201106；3. 上海市農(nóng)業(yè)遺傳育種重點實驗室，上海 201106)

氮素是作物生長發(fā)育不可缺少的大量元素之一，也是作物生長和發(fā)育的限制因子。20世紀中期以來，隨著人口的增長，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中為提高作物產(chǎn)量，開始大量甚至過量施用氮肥。目前，我國的氮肥施用總量居世界第一，且每公頃氮肥施用量遠高于發(fā)達國家[1]，然而，據(jù)估計這些氮肥僅30%～50%被作物吸收，其他均通過各種途徑直接或間接進入環(huán)境[2]。這不僅導(dǎo)致能源大量消耗，作物生產(chǎn)成本提高，還造成了嚴重的環(huán)境問題，如氮素進入水體引起赤潮以及帶來的海洋生物滅絕和生物多樣性破壞，導(dǎo)致土壤酸化、次生鹽漬化、地下水硝酸鹽含量超標及地表水體富營養(yǎng)化，還造成臭氧層空洞和全球變暖等[3-5]。開展作物耐低氮育種就成為解決上述問題的重要選擇[5-7]，而確定有效的篩選鑒定指標和提供足夠的耐低氮種質(zhì)資源是開展耐低氮育種的首要選擇。

大麥(HordeumvulgareL.)，是全球第四大禾谷類作物，被廣泛用于飼料、啤酒、食品、醫(yī)藥等行業(yè)。大麥因具有生育期短、適應(yīng)性廣和耐逆性強等優(yōu)點，一直受到科學(xué)家的廣泛關(guān)注，也被作為遺傳學(xué)研究的模式植物之一。而大麥地方品種又是中國大麥種質(zhì)資源的重要組成部分，蘊含大量的抗病、耐逆、優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)等優(yōu)異基因。上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院大麥細胞工程課題組前期收集了100多份上海地區(qū)大麥地方品種，并進行了遺傳多樣性分析，發(fā)現(xiàn)其遺傳背景比較豐富，從中篩選出耐低氮種質(zhì)對于上海地區(qū)的大麥耐低氮育種意義重大[8]。因此，本研究從中隨機挑選出19份大麥材料，采用水培法在苗期進行了耐低氮篩選指標的研究，相關(guān)指標可用于大麥耐低氮(氮高效)種質(zhì)篩選，并獲得耐低氮大麥地方品種，從而為大麥耐低氮育種提供一定的依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

19份大麥地方品種材料均來自上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院大麥細胞工程課題組收集組建的上海地區(qū)大麥地方品種庫，最初來源于上海市農(nóng)業(yè)生物基因中心，品種名稱及編號見表1。

1.2 試驗設(shè)計與方法

水培試驗于2017年6月在上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)所人工氣候室進行。營養(yǎng)液配制方法參照國際水稻所營養(yǎng)液配方，并略作修改。取適量大麥種子用10%消毒靈消毒10 min，清水沖洗干凈后室溫下浸種4～6 h，催芽過夜，種子露白后，放至濕潤濾紙待其發(fā)芽；7 d后，取生長一致的大麥幼苗，用海綿條包裹，移入打孔的泡沫板，每塊泡沫板平均分布40個孔(5×8)，隨后放入盛有正常供氮營養(yǎng)液的周轉(zhuǎn)箱(周轉(zhuǎn)箱規(guī)格為42 cm×30 cm×10 cm)，營養(yǎng)液pH值6.0左右，溫度約20 ℃，每天補水，并進行病蟲害管理，每周更換1次營養(yǎng)液。設(shè)低氮脅迫(0.5 mmol/L NH4NO3)和正常供氮(1.43 mmol/L NH4NO3)2個處理，每個品種每個處理設(shè)10次重復(fù)，氮源以NH4NO3形態(tài)供應(yīng)。在三葉期左右進行低氮脅迫處理，14 d后收苗，沖洗干凈，測定株高和根長，統(tǒng)計分蘗數(shù)。將根和地上部分開裝袋，105 ℃殺青1 h，然后70 ℃烘干至恒質(zhì)量，測定地上部干質(zhì)量和根干質(zhì)量。

采用凱氏定氮法測定地上部樣品氮素含量，每個樣品磨碎后過0.25 mm篩，取0.1 g左右進行消煮，然后定容至100 mL，取10 mL左右樣品通過流動分析儀進行氮素測定，然后根據(jù)陳志偉等[9-10]的方法計算單株吸氮量和氮素生理利用效率(這里指地上部)，分別用來估計氮素吸收效率和生理利用效率。每處理每品種設(shè)5次重復(fù)。

單株吸氮量(mg)=(氮素測定濃度×0.1×地上部干質(zhì)量)/測定所用樣品質(zhì)量。

氮素生理利用效率(g干質(zhì)量/g氮素)=地上部干質(zhì)量×1 000/單株吸氮量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2007分析整理數(shù)據(jù)并進行t測驗，采用SPSS 22.0軟件進行方差分析和多重比較。

表2 正常供氮和低氮脅迫下不同大麥地方品種相關(guān)性狀的方差分析Ta.2 Two-way ANOVA of traits in different barley landraces under normal-N supply and low-N stress

2 結(jié)果與分析

2.1 不同供氮水平下各大麥地方品種的性狀值的方差分析及均值變異情況

方差分析表明，不同供氮處理間所有性狀都存在極顯著差異(P<0.01)，不同品種間所有性狀也存在極顯著差異(P<0.01)，并且在不同供氮水平和不同品種間所有性狀均存在極顯著的互作效應(yīng)(P<0.01)(表2)，說明，針對這些性狀指標，本研究選擇的低氮脅迫濃度合理、有效，同時也可以從這些地方品種中篩選出相對耐低氮的材料。由表3可知，低氮脅迫對根干質(zhì)量表現(xiàn)出促進作用，其中B918、B929、B935、B938、B939、B942、B944、B945、B965和B968顯著提高；對株高、分蘗數(shù)、地上部干質(zhì)量則表現(xiàn)為抑制作用，其中株高，除了B936和B973外，都顯著降低，分蘗數(shù)，除了B936、B938、B940、B942和B973外，都顯著減少，地上部干質(zhì)量，除了B929、B942、B945、B968和B974外，都顯著減輕；對根長的影響則比較復(fù)雜，既有明顯促進作用(其中B929、B935、B937、B939、B942、B945、B968、B973和B974，顯著增長)，也有明顯抑制作用(其他B906、B940和B943，顯著減短)。這說明，低氮脅迫對大麥地上部和根的影響是不同的，其對大麥生長的影響通過地上部更容易體現(xiàn)出來，并且其對大麥生長的早期抑制可能主要先表現(xiàn)在地上部。

2.2 兩種供氮水平下各性狀的變異系數(shù)和相關(guān)性分析

由表3可知，在正常供氮條件下各性狀的基因型變異系數(shù)表現(xiàn)為：根干質(zhì)量>分蘗數(shù)>地上部干質(zhì)量>根長>株高，其中，根干質(zhì)量的變異系數(shù)最大(為23.68%)，說明其受基因型影響最明顯，另外地上部干質(zhì)量和分蘗數(shù)的變異系數(shù)也較大(分別為21.84%和22.88%)；在低氮脅迫下各性狀的基因型差異表現(xiàn)為：分蘗數(shù)>根干質(zhì)量>地上部干質(zhì)量>根長>株高，其中，分蘗數(shù)的變異系數(shù)最大(為39.55%)，干質(zhì)量指標次之(其中根干質(zhì)量為20.89%，地上部干質(zhì)量為18.47%)，說明，分蘗數(shù)受基因型影響最明顯，且分蘗數(shù)在低氮脅迫下其變異系數(shù)有明顯提高，表明這些指標可以較好地用于耐低氮篩選和鑒定。另外，株高性狀在2種供氮條件下變異系數(shù)均較小(其中正常供氮條件下為6.94%，低氮脅迫下為6.37%)，說明其受基因型差異的影響較小，不太適于耐低氮的篩選。

表3 正常供氮和低氮脅迫下不同大麥地方品種各性狀的均值比較和變異系數(shù)Tab.3 Comparison of mean value of each trait for each barley landrace between normal-N supply and low-N stress and the coefficient variation

注：表中數(shù)據(jù)為“平均數(shù)±標準差”，后面不同字母代表每個品種的每個性狀正常供氮和低氮脅迫間在0.05水平差異顯著。

Note: The data in the table are "Mean±standard deviation", the different letters mean the significant differences of each trait in each barley landrace at 0.05 level between normal-N supply and low-N stress.

大麥苗期各性狀的相關(guān)分析表明(表4)，在正常供氮條件下，除分蘗數(shù)和根長、株高之間相關(guān)性不顯著外，其他各性狀間都呈極顯著正相關(guān)，其中根干質(zhì)量和地上部干質(zhì)量達極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.803；在低氮脅迫下，雖然各性狀間的相關(guān)性與正常供氮時基本一致，但所有的相關(guān)系數(shù)均呈下降趨勢，其中地上部干質(zhì)量和根長、分蘗數(shù)僅呈顯著正相關(guān)，而分蘗數(shù)和根長間甚至呈負相關(guān)關(guān)系，盡管不顯著。說明，雖然供氮水平并未顯著影響各性狀間的相關(guān)性，但低氮脅迫使得各性狀間的相關(guān)性程度有所下降。

表4 正常供氮和低氮脅迫下各性狀間的相關(guān)系數(shù)Tab.4 Correlation coefficients among different traits under normal-N supply and low-N stress

注*、**. 相關(guān)系數(shù)在0.05和0.01水平上差異顯著，即顯著相關(guān)或者極顯著相關(guān)。

Note*,**.Significances of the correlation coefficient at 0.05 and 0.01 level, respectively.

2.3 兩種供氮水平下各大麥品種地上部干質(zhì)量的比較

干質(zhì)量指標，尤其是地上部干質(zhì)量，在作物耐低氮篩選中有重要作用，因此，本研究進一步分析了大麥品種地上部干質(zhì)量與耐低氮的關(guān)系。由表3可知，大麥品種B929、B942、B945、B968和B974的地上部干質(zhì)量在正常供氮和低氮脅迫下無顯著差異，其他品種地上部干質(zhì)量在低氮脅迫下則表現(xiàn)為顯著下降。通過地上部干質(zhì)量指標在正常供氮和低氮脅迫間的直接比較可以看出，B929、B942、B945、B968和B974這5個大麥品種具有很強的耐低氮性。比較低氮脅迫和正常供氮條件下各品種地上部干質(zhì)量的相對值可以看出，B929、B942、B945、B968和B974的相對地上部干質(zhì)量均在0.800 00以上，而B945和B968均高于0.900 00(表5)。然而，對于品種B918，雖然其地上部干質(zhì)量相對值也高于0.800 00，甚至高于品種B929，但其地上部干質(zhì)量在2種供氮條件間存在顯著差異，表明其耐低氮性不如B929。這也表明，從地上部干質(zhì)量指標看，耐低氮性強的大麥品種其相對值也較高，而相對值高的，其耐低氮性未必強。另外，值得注意的是，根據(jù)地上部干質(zhì)量差異分析獲得的5個耐低氮大麥品種，其根長和根干質(zhì)量(除B974的根干質(zhì)量外)在低氮脅迫下都明顯提高了，這說明根的促進生長可能有利于大麥應(yīng)對低氮脅迫。

表5 正常供氮和低氮脅迫下各大麥地方品種地上部干質(zhì)量的相對值Tab.5 Relative shoot dry weight of each barley landrace between normal-N supply and low-N stress

2.4 耐低氮大麥品種地上部單株吸氮量和氮素利用效率的比較

根據(jù)地上部干質(zhì)量在低氮脅迫下是否受到抑制的判斷標準，隨機分別選擇了3份耐低氮大麥品種(B929、B942和B968)和3份低氮敏感大麥品種(B940、B943和B965)，并對其在不同供氮條件下的地上部進行了氮素測定，其單株吸氮量和氮素生理利用效率比較結(jié)果見圖1。t測驗表明，所有大麥品種的這2個指標在正常供氮條件和低氮脅迫間的差異均達到顯著水平(P<0.05)，說明低氮脅迫下，所有品種的單株吸氮量均顯著下降，而氮素生理利用效率均顯著提高，因而很難以此來判斷耐低氮性。而比較不同品種間這2個指標的數(shù)值大小也發(fā)現(xiàn)，并非所有耐低氮品種的單株吸氮量高或氮素生理利用效率均高于低氮敏感品種。進而，比較其相對值(表6)發(fā)現(xiàn)，相對單株吸氮量或相對氮素生理利用效率與大麥耐低氮性間沒有必然聯(lián)系。因此，不管從哪個角度，僅憑單株吸氮量和氮素生理利用效率其中某一個指標來判斷耐低氮性非常困難。而當把相對單株吸氮量和相對氮素生理利用效率相乘，發(fā)現(xiàn)耐低氮品種其值均大于0.800 00，而低氮敏感品種則均小于0.800 00，如果用相對單株吸氮量和相對氮素生理利用效率對大麥耐低氮性進行判斷時，需要同時考慮這2個指標。

每個品種對應(yīng)的矩形條上的不同字母僅代表2種處理條件下其性狀值在0.05水平上差異顯著。Different letters above rectangular columns of each barley landrace only represent significant differences of the traits between two different treatments at 0.05 level.

表6 氮素吸收利用生理指標的相對值Tab.6 Relative values of nitrogen uptake and utilization efficiency

3 結(jié)論與討論

20世紀后期，育種家相繼開展了一系列的優(yōu)良品種培育，并在大量施用化肥的情況下極顯著地提高了作物產(chǎn)量，但是由此也導(dǎo)致了嚴重的生態(tài)環(huán)境問題。近年來，隨著中國“雙減”戰(zhàn)略的實施，作物生產(chǎn)不再單純追求高產(chǎn)，作物耐低氮品種培育成為育種工作的重要方向。篩選出優(yōu)良的作物品種是耐低氮育種的首要任務(wù)，篩選品種一般采用水培試驗、盆栽試驗和大田試驗等方式進行。雖然大田試驗結(jié)果最為可靠，但因其易受外界諸多因素的影響，而難以控制氮素濃度，因此，試驗重復(fù)性較差；同時，大田試驗周期長，耗時耗力，開展大規(guī)模育種工作較艱巨。盆栽試驗因采用土壤栽培，也存在準確控制難、試驗重復(fù)性差等問題。而水培試驗可以有效避開這些不利因素。姚立蓉等[11]采用營養(yǎng)液水培的方式研究大麥對不同濃度氮素的利用效率，發(fā)現(xiàn)該方式能精確控制溫度、濕度及處理的天數(shù)。許多學(xué)者在對作物的氮效率進行研究時也都采用了苗期水培的方式[9-18]。前人研究也表明，不同基因型苗期耐低氮鑒定和大田試驗存在相關(guān)性[9,16]，因此，本研究采用水培試驗的方式在苗期對大麥耐低氮進行篩選。

當然，在作物耐低氮篩選中，一系列行之有效的篩選指標也是必不可少的，盡管不同的研究者在不同的作物中開展耐低氮篩選，但是他們采取的指標還是比較相似的，如裴雪霞等[16]在小麥耐低氮指標篩選時，認為相對干質(zhì)量、相對分蘗數(shù)等指標變異系數(shù)比較高，適于小麥耐低氮篩選；童漢華等[17]進行水稻氮高效的篩選時，認為在苗期進行氮效率篩選指標可靠性以相對地上部干質(zhì)量>相對單株分蘗數(shù)>相對苗高為準；陳志偉等[9-10]、Yang等[14]和強欣[18]認為，相對干質(zhì)量等指標是適宜作為篩選指標。分析前人研究結(jié)果不難看出，干質(zhì)量是眾多作物的耐低氮篩選指標，且相關(guān)的機制研究也均以干質(zhì)量為重要參考[13,19]。本研究也發(fā)現(xiàn)，在正常供氮和低氮脅迫下干質(zhì)量的基因型差異都相對較大，且干質(zhì)量指標與其他性狀在不同的供氮水平下均呈顯著正相關(guān)，說明干質(zhì)量確實可以作為大麥耐低氮篩選和鑒定的重要指標。

目前，大麥耐低氮篩選中主要采用的是性狀相對值[9-10,14]。Yang等[14]提出以相對地上部干質(zhì)量作為大麥耐低氮性的判斷標準，根據(jù)不同品種在正常供氮和低氮處理下的表現(xiàn)，認為相對地上部干質(zhì)量(Relative shoot dry weight，RSDW)RSDW>0.9為耐低氮性品種，RSDW<0.7為低氮敏感品種，0.7

植物對氮素的吸收利用是一個非常復(fù)雜的過程，涉及很多生理生化過程[19-22]。因此，在分析植物耐低氮性狀時，研究植物對氮素的吸收和利用就非常重要。Moll等[23]研究表明，在低氮脅迫下，品種表現(xiàn)出氮高效或耐低氮可能是因為氮素吸收效率較高，也可能是因為氮素生理利用效率較高。本研究中，無論是根據(jù)低氮脅迫下的單株吸氮量或氮素生理利用效率的大小，還是相對單株吸氮量或相對氮素生理利用效率的大小，均無法判斷大麥品種和大麥苗期耐低氮間的準確關(guān)系，這也說明有些品種耐低氮性并不是僅與其中一個必然相關(guān)。而聯(lián)合考慮這2個指標，即將大麥地上部相對單株吸氮量和相對氮素生理利用效率相乘，發(fā)現(xiàn)耐低氮品種的這個乘積均高于0.80，而低氮敏感品種則均小于0.80，說明，同時考慮這2個指標才可能有效區(qū)分耐低氮品種和低氮敏感品種。本研究僅采用了6個品種，品種數(shù)較少，在此前提下產(chǎn)生的判斷標準可能還不夠準確，因此，后續(xù)研究中將選用更多的耐低氮差異品種來進行驗證。

致謝：感謝上海市農(nóng)業(yè)生物基因中心楊華老師在提供大麥種質(zhì)材料中給予的幫助。