寧亞維，劉祥貴，王志新，賈英民

（1.河北科技大學 生物科學與工程學院 /河北省發(fā)酵工程技術(shù)研究中心，河北 石家莊 050018；2.北京工商大學食品學院，北京 102488；3.河北省雜糧研究重點實驗室/河北省農(nóng)林科學院，河北 石家莊 050035）

γ-氨基丁酸（γ-amino butyric acid，GABA）是一種非蛋白質(zhì)氨基酸，由谷氨酸經(jīng)谷氨酸脫羧酶催化而來，是哺乳動物大腦抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，參與機體多重代謝活動[1-7]。GABA天然存在于糧食原料中（如豆類、蕎麥、大麥、大米等），但含量均較低，然而可以通過環(huán)境條件脅迫、微生物發(fā)酵、蛋白質(zhì)水解結(jié)合酶催化等手段富集[8-12]，因此目前糧食作物中GABA的富集成為研究的熱點。

小米糙米在發(fā)芽過程中內(nèi)源酶 （如蛋白酶、谷氨酸脫羧酶等）被激活，可以催化谷氨酸進行脫羧反應生成GABA；相反，GABA也會在GABA轉(zhuǎn)氨酶的作用下分解生成琥珀酸半醛，因此只有谷氨酸脫羧酶的活性超過γ-氨基丁酸、丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶時，γ-氨基丁酸的含量才會增加[13-14]。不同的溫度、發(fā)芽時間等發(fā)芽條件會影響GABA的生成與降解平衡，只有適宜的條件才會使得小米糙米中的GABA得到有效富集[15]。因此，作者擬以GABA生成量為指標，通過單因素試驗結(jié)合響應面優(yōu)化法探尋小米糙米發(fā)芽的最佳條件，以期獲得富集GABA的最佳工藝，為小米產(chǎn)品的開發(fā)提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

冀谷：河北省農(nóng)林科學院谷物研究所提供；GABA標準品：購自Sigma-Aldrich公司；無水乙醇、苯酚、次氯酸鈉、四硼酸鈉、硼酸等均為分析純：購自天津市永大化學試劑有限公司。

1.2 主要儀器與設備

Evolution 220紫外分光光度計：美國Thermo公司產(chǎn)品；SIGMA3-18K高速冷凍離心機：德國SIGMA公司產(chǎn)品；Lab dancer漩渦振蕩器：德國IKA產(chǎn)品產(chǎn)品；SPX-150B-Z型生化培養(yǎng)箱：上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠產(chǎn)品。GZX-9140MBE礱谷機：上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠產(chǎn)品。

1.3 試驗方法

1.3.1 小米糙米發(fā)芽工藝 首先挑選顆粒飽滿的冀谷19號谷子進行礱谷，人工去除雜質(zhì)及顆粒不完整的糙米，制備得到實驗可用的小米糙米。然后采用蒸餾水清洗去除雜質(zhì)，質(zhì)量分數(shù)0.5%的次氯酸鈉溶液浸泡30 min，再用無菌水清洗殘余次氯酸鈉對小米糙米進行消毒處理。之后于試驗設定條件下進行浸泡與發(fā)芽，其中發(fā)芽階段每隔12 h采用無菌水淋洗一次。最后于80℃條件下干燥2 h，粉碎待用。

1.3.2 GABA的提取與測定 準確稱取5.0 g小米糙米粉置于三角瓶中，首先加入15 mL無水乙醇提取糙米中的黃色素，于60℃水浴保溫2 h，然后于8 000 r/min離心20 min，上清液即為黃色素提取液，將其棄去留取沉淀物。向沉淀物中加入20 mL去離子水并置于震蕩水浴中提取GABA，在40℃的溫度下震蕩（150 r/min）提取1 h。然后將粗提取液于10 000 r/min條件下離心15 min，取上清液并定容至25 mL，所得溶液即為GABA提取液。

采用比色法測定GABA質(zhì)量分數(shù)。首先，量取0.4 mL提取液，向其中加入0.6 mL濃度為0.2 mol/L的硼酸緩沖液（pH 9.0）、2 mL苯酚溶液（體積分數(shù)6%）和1 mL有效氯為質(zhì)量分數(shù)9%的次氯酸鈉，震蕩均勻。然后于沸水浴加熱5 min，取出后立即置于冰浴中冷卻5 min，待出現(xiàn)藍綠色后加2 mL無水乙醇（體積分數(shù)60%），震蕩均勻并測定645 nm處的吸光值。

1.3.3 發(fā)芽條件優(yōu)化與設計

1）單因素試驗 小米糙米發(fā)芽試驗中設定浸泡溫度、浸泡時間、發(fā)芽溫度和發(fā)芽時間4個因素，以發(fā)芽小米糙米中GABA質(zhì)量分數(shù)為考察指標進行單因素試驗。

2）優(yōu)化試驗 在單因素試驗基礎上，選取浸泡溫度、浸泡時間和發(fā)芽溫度3個主要影響為自變量，以GABA含量為響應值，設計3因素3水平響應面分析實驗。其中3個自變量的范圍及水平編碼如表1所示。

表1 Box-Behnken響應面設計試驗因素水平及編碼Table 1 Factor level and code of Box-Behnken design

1.3.4 統(tǒng)計分析 采用origin 8.5進行數(shù)據(jù)處理及圖表繪制，采用Design-Expert 7.0統(tǒng)計軟件做方差分析與響應面分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 浸泡溫度對GABA質(zhì)量分數(shù)的影響

分別設定小米糙米的浸泡溫度為：25、30、35、40℃，浸泡時間8 h，每隔2 h更換浸泡液一次，發(fā)芽溫度為30℃，發(fā)芽時間為48 h。小米發(fā)芽糙米的GABA含量如圖1所示?？梢钥闯觯菀簻囟仍?5到35℃之間，小米發(fā)芽糙米中的GABA含量隨著浸泡溫度的升高而增加，浸泡溫為在35℃時小米發(fā)芽糙米中的GABA質(zhì)量分數(shù)達到最大值78.60 mg/hg；當浸泡溫度增加為40℃時，GABA小米發(fā)芽糙米中的含量不但沒有增加反而還有所降低。因此，實驗將小米糙米發(fā)芽的最佳浸泡溫度選定為30～40℃。此外，未發(fā)芽的糙米GABA質(zhì)量分數(shù)為21.90 mg/hg，此研究表明浸泡能夠顯著提高糙小米中GABA質(zhì)量分數(shù)。

圖1 浸泡溫度對GABA質(zhì)量分數(shù)的影響Fig.1 Effect of soaking temperature on the content of GABA

2.2 浸泡時間對GABA質(zhì)量分數(shù)的影響

分別設定浸泡時間為：0、4、8、12、16、20 h，浸泡液溫度為35℃，其他條件為發(fā)芽溫度30℃，發(fā)芽時間48 h。小米發(fā)芽糙米中GABA質(zhì)量分數(shù)如圖2所示。由圖2可知，隨著小米糙米浸泡時間的延長，小米發(fā)芽糙米中GABA質(zhì)量分數(shù)呈現(xiàn)先增加后減少的變化趨勢，當浸泡時間為12 h時，GABA質(zhì)量分數(shù)最高可達101.15 mg/hg。因此，將小米糙米的最佳浸泡時間選定為8～16 h。

2.3 發(fā)芽溫度對GABA質(zhì)量分數(shù)的影響

分別設定發(fā)芽溫度為：25、30、35、40 ℃，浸泡液溫度為35℃，浸泡時間12 h，發(fā)芽時間為48 h。小米發(fā)芽糙米中GABA質(zhì)量分數(shù)如圖3所示。由圖3可知，在35℃之前，小米發(fā)芽糙米中GABA質(zhì)量分數(shù)隨溫度的升高而增加，在35℃時，小米發(fā)芽糙米中的GABA質(zhì)量分數(shù)最高為118.82 mg/hg，但溫度在超過35℃后，GABA質(zhì)量分數(shù)隨溫度的升高而降低。因此，選取最佳發(fā)芽溫度為30～40℃。

圖2 浸泡時間對GABA質(zhì)量分數(shù)的影響Fig.2 Effect of soaking time on the content of GABA

圖3 發(fā)芽溫度對GABA質(zhì)量分數(shù)的影響Fig.3 Effect of germination temperature on the content of GABA

2.4 發(fā)芽時間對GABA質(zhì)量分數(shù)的影響

分 別 設 定 發(fā) 芽 時 間 為 ：12、24、36、48、60、72、84、96、108、120 h，浸泡液溫度為 35 ℃，浸泡時間為12 h，發(fā)芽溫度為35℃。小米發(fā)芽糙米中GABA含量如圖4所示。由圖4可知，隨著小米糙米發(fā)芽時間的延長，GABA富集量逐漸增加，且在24 h到60 h之間GABA質(zhì)量分數(shù)增長迅速，當發(fā)芽時間達到60 h時，GABA質(zhì)量分數(shù)達到峰值181.34 mg/hg。因此，選取最佳發(fā)芽時間為48～72 h。

2.5 響應面分析

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，響應面優(yōu)化試驗設定浸泡溫度 30～40 ℃，浸泡時間 8～16 h，發(fā)芽溫度 30～40℃，發(fā)芽時間60 h，采用Box-Behnken響應面設計法，優(yōu)化影響小米糙米富集GABA的關(guān)鍵工藝條件。試驗設計及結(jié)果見表2，回歸模型方差分析見表3。

圖4 發(fā)芽時間對GABA質(zhì)量分數(shù)的影響Fig.4 Effect of germination time on the content of GABA

經(jīng)分析得到的小米糙米發(fā)芽條件與小米發(fā)芽糙米中GABA含量間的二次多項式回歸模型為：Y=178.74-17.20A+9.18B-21.27C+9.92AB-8.56AC-2.61BC-43.91A2-49.56B2-67.20C2，其中A為浸泡溫度，B為浸泡時間，C為發(fā)芽溫度。

由上述表3的方差分析結(jié)果可知，模型水平顯著，失擬項水平不顯著，表明本試驗建立的回歸模型能真實地描述小米糙米在發(fā)芽過程的GABA含量與發(fā)芽條件之間的規(guī)律。其中C2對發(fā)芽小米糙米中GABA質(zhì)量分數(shù)影響極顯著，A2、B2對發(fā)芽小米糙米中GABA質(zhì)量分數(shù)影響顯著，AB、AC、BC發(fā)芽小米糙米中GABA質(zhì)量分數(shù)影響不顯著。因此，該模型可用于預測小米糙米在發(fā)芽中GABA質(zhì)量分數(shù)。

表2 響應面試驗設計及結(jié)果Table 2 Response surface design experiments and the corresponding GABA contents

通過優(yōu)化分析得到小米糙米發(fā)芽的最佳的工藝條件為浸泡溫度設定在34.14℃、浸泡時間設定12.32 h、發(fā)芽溫度設定為34.26℃，在上述條件下發(fā)芽60 h，小米發(fā)芽糙米中GABA質(zhì)量分數(shù)模型預測值為182.17 mg/hg。依據(jù)模型優(yōu)化結(jié)果與實際情況，浸泡溫度選定為34℃、浸泡時間選定為12 h、發(fā)芽溫度選定為34℃，發(fā)芽60 h對模型進行驗證，結(jié)果小米發(fā)芽糙米中GABA質(zhì)量分數(shù)為184.75 mg/hg，與預測值擬合度為101.42%，說明模型驗證良好。該優(yōu)化工藝較優(yōu)化前提高了2.76倍，較未發(fā)芽前提高了8.44倍。因此，該研究表明優(yōu)化后的發(fā)芽工藝能夠有效地提高小米糙米中GABA的富集量。

表3 回歸模型的方差分析Table 3 Analysis of variance（ANOVA） for response surface quadratic model

3 結(jié) 語

通過單因素試驗和響應面優(yōu)化試驗，確立了小米糙米富集GABA的發(fā)芽工藝條件：浸泡溫度34℃、浸泡時間12 h、發(fā)芽溫度34℃和發(fā)芽時間60 h，在此優(yōu)化條件下小米發(fā)芽糙米中GABA質(zhì)量分數(shù)達到184.75 mg/hg，較未發(fā)芽前提高了8.44倍。