余 蘭，黃麗雯，龔 亮，楊 菁，彭云娟

(福建醫(yī)科大學(xué)附屬寧德市醫(yī)院檢驗(yàn)科，福建寧德 352100)

核苷(酸)類似物(NAs)是臨床最常用的抗乙型肝炎病毒(HBV)藥物，通過靶向抑制HBV逆轉(zhuǎn)錄酶的活性發(fā)揮抗病毒作用。HBV在復(fù)制過程中，由于其高復(fù)制率及逆轉(zhuǎn)錄酶校對(duì)功能的缺乏，具有高度的變異性。在宿主的選擇壓力下，可形成一個(gè)或幾個(gè)優(yōu)勢(shì)突變株，即準(zhǔn)種。長(zhǎng)期應(yīng)用NAs時(shí)，對(duì)藥物壓力適應(yīng)性強(qiáng)的突變株成為優(yōu)勢(shì)群，從而對(duì)NAs產(chǎn)生耐藥性，導(dǎo)致治療失敗。然而近期越來越多的研究表明，在未經(jīng)NAs治療的慢性乙型肝炎(CHB)患者中，就存在耐藥位點(diǎn)突變，即預(yù)存耐藥變異。預(yù)存耐藥變異與NAs治療中的原發(fā)無應(yīng)答、應(yīng)答不佳或部分病毒學(xué)應(yīng)答密切相關(guān)[1-2]，引起了臨床的高度關(guān)注。本研究采用基因芯片法，對(duì)未經(jīng)NAs治療的CHB患者及慢性HBV攜帶者進(jìn)行多位點(diǎn)耐藥突變檢測(cè)，并分析預(yù)存耐藥變異與患者年齡、性別、谷氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、乙型肝炎e抗原(HBeAg)、HBV-DNA載量之間的關(guān)系。旨在明確寧德地區(qū)HBV預(yù)存耐藥變異情況，為臨床制訂個(gè)體化抗病毒治療方案提供可靠依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇本院2014-2015年收治的CHB患者及慢性HBV攜帶者401例為研究對(duì)象。其中男247例，女154例，平均年齡34.79歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)HBV-DNA≥104IU/mL；(2)從未使用過NAs治療或用藥史不明確；(3)診斷均符合2015年中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病學(xué)分會(huì)、感染病學(xué)分會(huì)修訂的《慢性乙型肝炎防治指南》的診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)肝硬化及肝癌患者；(2)有嚴(yán)重基礎(chǔ)疾病；(3)有遺傳性或代謝性疾病史；(4)合并甲型肝炎病毒(HAV)、丙型肝炎病毒(HCV)、丁型肝炎病毒(HDV)、戊型肝炎病毒(HEV)及人類免疫缺陷病毒(HIV)感染者。

1.2方法

1.2.1生化檢測(cè) 采用羅氏cobas c501生化儀及羅氏診斷試劑檢測(cè)患者ALT等生化指標(biāo)。

1.2.2HBV血清標(biāo)志物檢測(cè) 采用CHEMCLIN1500全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀，試劑購自博陽生物科技公司，檢測(cè)血清HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb。

1.2.3HBV-DNA定量檢測(cè) 運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，試劑盒購自達(dá)安基因股份有限公司，檢測(cè)儀器為ABI StepOnePlus實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀。

1.2.4HBV多位點(diǎn)耐藥突變檢測(cè) 采用珠海賽樂奇生物技術(shù)有限公司提供的HBV耐藥突變位點(diǎn)檢測(cè)試劑盒及基因芯片檢測(cè)平臺(tái)，運(yùn)用基因芯片技術(shù)進(jìn)行HBV多位點(diǎn)耐藥突變檢測(cè)。其檢測(cè)原理為使用PCR技術(shù)擴(kuò)增HBV的特定基因片段，再與芯片上特異性核酸探針雜交以檢測(cè)特定的基因位點(diǎn)的突變，通過生物信號(hào)原位放大技術(shù)，使基因芯片雜交信號(hào)放大到肉眼判讀的水平，檢測(cè)逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)rt180、rt181、rt184、rt194、rt202、rt204、rt236、rt250等8個(gè)突變位點(diǎn)，涉及拉米夫定(LAM)、阿德福韋(ADV)、恩替卡韋(ETV)、替比夫定(LDT)、替諾福韋(TDF) 以及恩曲他濱(FTC)6種臨床上常用的NAs。

2 結(jié) 果

2.1耐藥位點(diǎn)突變情況 本研究對(duì)逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)rtL180M、rtA181V/T、rtT184A/G、rtA194T、rtS202G、rtM204V/I、rtN236T、rtM250V 8個(gè)主要耐藥位點(diǎn)檢測(cè)，突變位點(diǎn)主要集中在rtN236T、rtM204I、rtL180M 3個(gè)位點(diǎn)，突變率分別為15.96%、6.98%、5.24%。rtM204I較rtM204V更為常見,rtN236T的突變率高于rtM204V/I。各位點(diǎn)突變情況見表1。

表1 耐藥位點(diǎn)突變情況

表2 預(yù)存耐藥變異模式

2.2預(yù)存耐藥變異模式 401例患者中，檢出預(yù)存耐藥變異79例，耐藥率為19.70%，其中單個(gè)位點(diǎn)突變48例，多個(gè)位點(diǎn)突變31例，前3位的突變模式為rtN236T、rtN236T+rtM204I+rtM204V、rtN236T+rtM204I，其突變率分別為9.98%、2.24%、1.25%。具體預(yù)存耐藥變異模式見表2。

2.3常用藥物的預(yù)存耐藥變異情況 本研究針對(duì)6種臨床上常用的抗病毒藥物進(jìn)行預(yù)存耐藥變異研究，包括L-核苷(酸)類似物(LAM、LDT)，無環(huán)核苷(酸)類似物(ADV、TDF)，脫氧鳥苷類似物(ETV)，胞嘧啶核苷類似物(FTC)等。預(yù)存耐藥變異檢出率從高到低分別為ADV(15.96%)、LAM(7.48%)、FTC(7.48%)、LDT(6.98%)、TDF(0.50%)、ETV(0.25%)。具體變異情況見表3。

表3 藥物的預(yù)存耐藥變異情況

2.4預(yù)存耐藥變異與患者年齡、性別的關(guān)系 本研究共納入患者401例，年齡2～81歲，年齡中位數(shù)為31歲。其中男247例，女154例，具體見表4、5。本研究中，年齡較小及較大組別突變率更高，女性突變率高于男性。對(duì)突變組和未突變組的年齡、性別進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表4 預(yù)存耐藥變異與患者年齡的關(guān)系

表5 預(yù)存耐藥變異與患者性別的關(guān)系

2.5預(yù)存耐藥變異與患者ALT、AST之間的關(guān)系 根據(jù)《慢性乙型肝炎防治指南(2015版)》[3]建議，以ALT、AST的正常上限(ULN)為參考，肝酶升高程度可分為<1 ULN、1～2 ULN、>2～10 ULN以及>10 ULN。對(duì)突變組和未突變組的肝酶升高情況進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，ALT、AST差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。在>10 ULN組別中，耐藥突變率較高，突變率隨肝酶升高呈上升趨勢(shì)。見表6、7和圖1。

表6 預(yù)存耐藥變異與患者ALT之間的關(guān)系

注：ULN=40 U/L

表7 預(yù)存耐藥變異與患者AST之間的關(guān)系

注：ULN=35 U/L

圖1 預(yù)存耐藥變異率與肝酶的關(guān)系

2.6預(yù)存耐藥變異與患者HBeAg陽性率、HBV-DNA載量之間的關(guān)系 由于耐藥檢測(cè)試劑盒對(duì)HBV-DNA載量有最低限要求，故本研究中HBV-DNA的納入標(biāo)準(zhǔn)為≥104IU/mL，以103為級(jí)差，將病毒載量分為低、中、高3個(gè)級(jí)別，病毒載量高的組別突變率較高，對(duì)耐藥突變情況進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，兩組之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.41，P>0.05)。見表8。

表8 預(yù)存耐藥變異與HBV-DNA載量之間的關(guān)系

HBeAg陽性的患者其突變率高于陰性患者。但對(duì)突變組和未突變組HBeAg的表達(dá)情況進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，兩組之間在HBeAg表達(dá)情況上的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=2.261，P>0.05)。見表9。

表9 預(yù)存耐藥變異與患者HBeAg陽性率之間的關(guān)系

3 討 論

大量研究表明，CHB患者在NAs治療前就存在耐藥位點(diǎn)突變，即預(yù)存耐藥變異。該變異可能是引起抗病毒治療原發(fā)性無應(yīng)答、應(yīng)答不佳或部分病毒學(xué)應(yīng)答的主要原因之一。預(yù)存耐藥變異產(chǎn)生的原因可能為以下兩方面。(1)HBV慢性感染期間與宿主免疫應(yīng)答相互作用的結(jié)果：HBV-DNA逆轉(zhuǎn)錄酶缺乏嚴(yán)格的校對(duì)功能,每天能產(chǎn)生1010～1011個(gè)新發(fā)的核酸替換，形成大量的突變株。在遺傳變異、競(jìng)爭(zhēng)及宿主的選擇壓力下，耐藥突變被逐漸篩選出來成為優(yōu)勢(shì)株，或者僅存在于少量被感染的肝細(xì)胞中。受檢測(cè)方法的敏感度所限，預(yù)存耐藥變異的優(yōu)勢(shì)株易被檢出，而非優(yōu)勢(shì)株可能被漏檢，在臨床上可表現(xiàn)為治療前未檢測(cè)到耐藥突變，抗病毒治療后原發(fā)無應(yīng)答、應(yīng)答不佳或迅速檢測(cè)到耐藥突變[4]。(2)HBV耐藥株的水平或垂直傳播，即患者可能最初直接感染了耐藥株[5-6]。

本研究對(duì)未經(jīng)NAs治療的401例CHB患者及慢性HBV感染者進(jìn)行耐藥突變檢測(cè)，共檢出預(yù)存耐藥變異79例，耐藥率為19.70%，相關(guān)藥物的預(yù)存耐藥檢出率從高到低分別為ADV、LAM、FTC、LDT、TDF、ETV。類似研究中，預(yù)存耐藥變異多以LAM為主，ADV次之，其他藥物少見[7-8]。本研究中各種藥物均檢出了相關(guān)的耐藥位點(diǎn)預(yù)存變異，且ADV的預(yù)存耐藥變異較LAM更為嚴(yán)重，高達(dá)15.96%，較LAM高出一倍，此種差異可能與檢測(cè)方法、地域、用藥習(xí)慣等有關(guān)，原因有待進(jìn)一步研究。

HBV預(yù)存耐藥的檢出率可能與檢測(cè)方法有關(guān)。蓋洪鵬等[9]采用微測(cè)序技術(shù)，檢出CHB患者的預(yù)存耐藥率為17.19%，突變位點(diǎn)主要與 LAM、ADV 耐藥相關(guān)。孫靜怡等[10]用基因芯片法檢測(cè)乙型肝炎相關(guān)性原發(fā)性肝癌術(shù)后患者的預(yù)存耐藥情況，提示預(yù)存耐藥檢出率為19.12%，相關(guān)藥物為L(zhǎng)AM、LDT、ADV。饒友義等[2]、陳燦峰等[7]亦采用基因芯片法，預(yù)存耐藥檢出率分別為14.57%、15.57%，耐藥藥物為L(zhǎng)AM、ADV。與基因芯片技術(shù)相比，以PCR擴(kuò)增產(chǎn)物焦磷酸測(cè)序進(jìn)行預(yù)存耐藥變異的檢出率較低，為4.92%～8.97%[11-12]。羅新月等[13]應(yīng)用克隆測(cè)序法在60例CHB患者中檢出33 例逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)基因變異，預(yù)存耐藥檢出率高達(dá)53.3%。提示預(yù)存耐藥變異可能較文獻(xiàn)報(bào)道的情況更為普遍。受檢測(cè)方法的特異度與敏感度影響，預(yù)存耐藥變異的檢出率有較大差別，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)按照實(shí)際情況，選擇合適的檢測(cè)方法。本研究采用基因芯片法進(jìn)行突變檢測(cè)，檢出率為19.70%，與其他相同檢測(cè)方法的研究相比，檢出率相近。筆者認(rèn)為，基因芯片法操作簡(jiǎn)單，檢測(cè)時(shí)間短，檢出率較高，設(shè)備成本低，較適宜臨床推廣。

本研究突變位點(diǎn)主要集中在rtN236T、rtM204I、rtL180M，突變率分別為15.96%、6.98%和5.24%，rtM204I較rtM204V更為常見。與目前報(bào)道的預(yù)存耐藥位點(diǎn)多位于rtM204V/I、rtL180M、rtN236T基本一致[10-13]，但本研究中rtN236T的突變率較其他研究高。分析突變模式，單個(gè)位點(diǎn)突變48例，多個(gè)位點(diǎn)突變31例。前3位為rtN236T、rtN236T+rtM204I+rtM204V、rtN236T+rtM204I，其突變率分別為9.98%、2.24%及1.25%。與用藥后的耐藥突變相比，預(yù)存耐藥的單個(gè)點(diǎn)突變發(fā)生率較高，復(fù)雜程度較低，但單位點(diǎn)突變與多位點(diǎn)突變的患者在年齡、性別等方面的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，未統(tǒng)計(jì)病程長(zhǎng)短方面的差異。有研究提示，伴隨疾病進(jìn)展和治療的進(jìn)行，突變的發(fā)生率及復(fù)雜程度明顯上升[13]。

統(tǒng)計(jì)分析預(yù)存耐藥突變可能的相關(guān)因素，提示預(yù)存耐藥突變組與未突變組，在年齡、性別、ALT、AST、病毒載量、HBeAg等方面的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。但提示年齡<20歲及>60歲，肝酶>10 ULN，病毒載量>107IU/mL、HBeAg陽性的患者，其預(yù)存耐藥變異檢出率較高。此類患者可能更需要謹(jǐn)慎用藥，推薦抗病毒治療前進(jìn)行耐藥基因突變檢測(cè)。為明確預(yù)存耐藥突變的影響因素，需加大樣本量，細(xì)化分組，增加病程、病理分型等研究因素，進(jìn)一步研究影響其相關(guān)因素和發(fā)生機(jī)制。

在臨床治療方面，除目前臨床常用的LAM、ADV、LDT、TDF及ETV外，本文還對(duì)FTC進(jìn)行了耐藥位點(diǎn)突變檢測(cè)。該藥物為胞嘧啶核苷類似物，最早用于HIV感染的治療。其耐藥突變位點(diǎn)與LAM相同，即rtM204V/I±rtL180M變異，本研究中預(yù)存耐藥檢出率為7.48%，與LAM一致。自2006年起，F(xiàn)TC被用于CHB的抗病毒治療,研究證實(shí)FTC聯(lián)合TDF抑制HBV作用優(yōu)于TDF單藥制劑，并能夠減少耐藥發(fā)生[14]。其安全耐受性已獲得廣泛認(rèn)可。目前推薦FTC與TDF聯(lián)合，用于初治與經(jīng)治HIV/HBV共感染者。在充分的知情同意后，可用于兒童CHB患者、妊娠期HBV感染母嬰垂直傳播阻斷以及妊娠期HBV感染活動(dòng)者的抗病毒治療[15],為CHB的抗病毒治療提供新的治療選擇[14,16]。

2016年更新的CHB NAs經(jīng)治患者抗病毒治療專家共識(shí)[17]中指出，高病毒載量的CHB患者采用ADV、LAM或LDT等單藥治療時(shí)HBV-DNA低于檢測(cè)下限的比率較低，且耐藥變異發(fā)生率較高，其中ADV治療產(chǎn)生原發(fā)無應(yīng)答的概率較大(10%～20%)，ETV、TDF治療發(fā)生原發(fā)無應(yīng)答的概率較小。本研究中ADV、LAM、FTC、LDT的預(yù)存耐藥變異率較高，其中ADV的突變率最高，為15.96%，TDF及ETV的預(yù)存耐藥突變率僅為0.50%和0.25%，與指南中NAs原發(fā)無應(yīng)答的概況相符，提示預(yù)存耐藥變異與原發(fā)無應(yīng)答高度相關(guān)。寧德地區(qū)應(yīng)遵循指南進(jìn)行臨床診療，臨床醫(yī)師對(duì)預(yù)存耐藥變異應(yīng)充分重視。在條件允許的情況下，治療前應(yīng)進(jìn)行耐藥基因突變檢測(cè)。若未進(jìn)行耐藥突變檢測(cè)，寧德地區(qū)應(yīng)慎用ADV等預(yù)存耐藥變異率較高的藥物。

寧德地區(qū)CHB患者及慢性HBV攜帶者的預(yù)存耐藥變異率較高，以rtN236T突變最為常見，相關(guān)藥物ADV應(yīng)慎用。TDF、ETV的預(yù)存耐藥變異檢出率低，抗病毒治療時(shí)可首選?？共《局委熐斑M(jìn)行多位點(diǎn)耐藥突變檢測(cè)，對(duì)指導(dǎo)個(gè)體化用藥具有重要的臨床意義。