常 芬

(武漢市普仁醫(yī)院呼吸內(nèi)科，湖北武漢 430081)

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一種以持續(xù)性氣流受限為特征的呼吸系統(tǒng)疾病[1]。作為一種不完全可逆的氣流受限而進(jìn)行性發(fā)展的慢性病，吸煙、遺傳及個(gè)體易感等多種因素通常被認(rèn)為與COPD的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)，而且隨著現(xiàn)代社會(huì)的發(fā)展及環(huán)境污染的日益嚴(yán)重，影響COPD發(fā)生、發(fā)展的因素也變得多樣[2]。從病理及免疫學(xué)的角度出發(fā)，呼吸道縮窄阻塞的過(guò)程通常與一系列復(fù)雜的由吸入顆粒物及有害氣體所引起的慢性炎性反應(yīng)密切相關(guān)，黏膜下多種炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及細(xì)胞、體液免疫不同程度的改變使氣流阻塞成進(jìn)行性發(fā)展[3]。而且COPD的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中會(huì)合并嚴(yán)重的并發(fā)癥，如肺癌、心腦血管疾病、糖尿病等，因此，COPD已成為威脅人民身體健康及生活質(zhì)量的重要疾病[4-5]，成為受社會(huì)廣泛關(guān)注的健康問(wèn)題。

曾有相關(guān)研究指出，COPD患者1型輔助性T細(xì)胞(Th1)的免疫應(yīng)答在COPD患者中受限，Th1細(xì)胞主要通過(guò)釋放γ干擾素 (IFN-γ) 活化巨噬細(xì)胞，增強(qiáng)其殺傷已被吞噬的病原體的能力。細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4(CTLA-4)又名CD152，是一種白細(xì)胞分化抗原，是T細(xì)胞上的一種跨膜受體，與CD28共同享有B7分子配體，而CTLA-4與B7分子結(jié)合后誘導(dǎo)T細(xì)胞無(wú)反應(yīng)性，參與免疫反應(yīng)的負(fù)調(diào)節(jié)。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Tregs)可以持續(xù)表達(dá)CTLA-4并以此影響效應(yīng)T細(xì)胞。有研究表明，COPD患者的CTLA-4+T細(xì)胞及CTLA-4+Treg細(xì)胞顯著高于健康人[6]，因此，本次研究假設(shè)CTLA-4+表達(dá)過(guò)度是Th1細(xì)胞免疫功能障礙的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，并最終導(dǎo)致COPD患者肺部受到細(xì)菌性感染，并找到COPD患者Th1細(xì)胞功能障礙的關(guān)鍵免疫調(diào)節(jié)環(huán)節(jié)，進(jìn)一步尋找改善患者Th1細(xì)胞功能的方法。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2013年1月至2017年1月于本院收治的40例急性加重慢性阻塞性肺疾病(AECOPD)且無(wú)肺部細(xì)菌性感染的患者作為病例組，同時(shí)選取40例平穩(wěn)期慢性阻塞性肺疾病(sCOPD)患者作為對(duì)照組。入選標(biāo)準(zhǔn)：(1)所有受試者均依照中華醫(yī)學(xué)會(huì)《慢性阻塞性肺疾病診治指南》確診[7]；(2)穩(wěn)定期的判斷均按照中華醫(yī)學(xué)會(huì)呼吸病學(xué)分會(huì)及原衛(wèi)生部醫(yī)政司相關(guān)指南及診療規(guī)范要求[7]；(3)AECOPD患者除需滿足前文所述納入標(biāo)準(zhǔn)外，需經(jīng)痰培養(yǎng)確認(rèn)未合并肺部細(xì)菌性感染。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并肝臟、心臟、腎臟及血液系統(tǒng)疾病；(2)本研究前2周使用過(guò)免疫抑制劑的患者；(3)本研究前2周使用過(guò)全身激素的患者。被納入本次研究的所有研究對(duì)象均為漢族，其中AECOPD組男性患者24例，女性患者16例；sCOPD組男性患者22例，女性患者18例。納入的研究對(duì)象人口學(xué)特征在組間分布均衡可比。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)討論通過(guò)，所有患者均知情且自愿參加，并簽署了知情同意書(shū)。

1.2方法

1.2.1血漿分離制備 對(duì)所有研究對(duì)象取新鮮外周血，并3 000 r/min離心10 min，上層血清用移液槍吸入EP管中置于超低溫冰箱-80 ℃保存待統(tǒng)一酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)。將需檢測(cè)血清從冰箱中取出常溫下自然化凍后使用檢測(cè)試劑檢測(cè)血清樣本中目標(biāo)成分的水平，使用多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)。分離后的血漿單核細(xì)胞(PBMC)置于10%的胎牛血清中。

1.2.2CTLA-4+細(xì)胞比例測(cè)定 取sCOPD組及AECOPD組等量PBMC及加入胎牛血清后在37 ℃、5% CO2的條件下傾斜靜置24 h，再過(guò)2 h加入布雷菲德菌素(1 μg/mL)或莫能菌素(2 μmol/L)加上CTLA-4別藻藍(lán)蛋白抗體，以便檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)及細(xì)胞外CTLA-4。清洗細(xì)胞后用Fixable Viability Stain 450、CD3-APC-H7、CD4-V500、CD8-Peridinin chlorophyll protein-Cy5.5及CD45RAphycoerythrin-Cy7進(jìn)行細(xì)胞表面著色；同時(shí)應(yīng)用Human Foxp3 buffer sets、Foxp3-phycoerythrin 及CTLA-4-APC抗體進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)染色，后用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。

1.2.3抗CTLA-4抗體阻斷 取等量sCOPD組及AECOPD組PBMC各一份加入抗CD3抗體，再取等量AECOPD組PBMC一份加入抗CD3抗體及抗CTLA-4 抗體，將3份PBMC樣本置于96孔平板培養(yǎng)24 h，上層培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移并儲(chǔ)存在-80 ℃ 冰箱中存儲(chǔ)，取出培養(yǎng)物后經(jīng)自然化凍并應(yīng)用ELISA法檢測(cè)其中IFN-γ及腫瘤壞死因子-α(TNF-α)水平。

1.2.4儀器與試劑 本次研究所使用的離心機(jī)為邁達(dá)TDM3-120m；檢測(cè)血清生物標(biāo)志物所使用的多功能酶標(biāo)儀為安圖斯-PHOMO；流式細(xì)胞儀為賽默飛生產(chǎn)的Attune NxT；布雷菲德菌素及莫能菌素來(lái)源于BD公司生產(chǎn)的GolgiPlug產(chǎn)品；CTLA-4-APC及Foxp3-phycoerythrin均為 BD公司生產(chǎn)；進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)CTLA-4染色使用的Fixable Viability Stain 450為BD公司生產(chǎn)的Horizon產(chǎn)品；Human Foxp3 buffer sets為BD公司生產(chǎn)的Pharmingen產(chǎn)品；用于細(xì)胞培養(yǎng)的抗CD3抗體為Mabtech公司生產(chǎn)；TNF-α的ELISA檢測(cè)試劑由BD公司生產(chǎn)(557966)；IFN-γ的ELISA檢測(cè)試劑由Cusabio公司生產(chǎn)(E04577h)。在整個(gè)研究過(guò)程中，所有操作均按照說(shuō)明書(shū)嚴(yán)格執(zhí)行，并且所有操作均符合實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié) 果

2.1兩組患者人口學(xué)特征及基礎(chǔ)狀況分析 對(duì)sCOPD組與AECOPD組的人口學(xué)特征及基線情況分析發(fā)現(xiàn)，兩組患者性別、年齡及吸煙比例等人口學(xué)特征組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。而標(biāo)志著系統(tǒng)炎癥的血清高敏C反應(yīng)蛋白(hs-CRP)及血清可溶性腫瘤壞死因子受體1(sTNFR1)水平在兩組間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，AECOPD患者的血清hs-CRP值及血清sTNFR1值均高于sCOPD患者。見(jiàn)表1。

表1 兩組患者人口學(xué)特征及基礎(chǔ)狀況分析

注:*表示對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后服從正態(tài)分布

2.2兩組患者CTTLA-4+細(xì)胞比例分析 對(duì)兩組患者外周血細(xì)胞的分析可以看出，sCOPD患者Treg細(xì)胞在所有CD4+細(xì)胞中的比例為4.35%；AECOPD患者Treg細(xì)胞在所有CD4+細(xì)胞中的比例為5.12%，兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。sCOPD患者細(xì)胞內(nèi)CTLA-4+細(xì)胞在Treg細(xì)胞及CD4+細(xì)胞的比例分別為54.47%和8.13%；AECOPD患者細(xì)胞內(nèi)CTLA-4+細(xì)胞在Treg細(xì)胞及CD4+細(xì)胞的比例分別為50.14%和7.61%，兩組間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。sCOPD患者表面CTLA-4+細(xì)胞在Treg細(xì)胞及CD4+細(xì)胞的比例分別為8.69%和1.08%；AECOPD患者表面CTLA-4+細(xì)胞在Treg細(xì)胞及CD4+細(xì)胞的比例分別為20.74%和2.31%，兩組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。AECOPD患者表面CTLA-4+在Treg細(xì)胞及CD4+細(xì)胞中所占比例均高于sCOPD患者。見(jiàn)表2。

2.3兩組患者PBMC經(jīng)不同方式培養(yǎng)后血清中IFN-γ及TNF-α水平分析 對(duì)兩組患者PBMC分別加入抗CD3抗體，另取等量AECOPD患者血清加入抗CD3抗體+抗CTLA-4抗體分別培養(yǎng)后測(cè)定培養(yǎng)物中IFN-γ及TNF-α水平，發(fā)現(xiàn)3組培養(yǎng)物的IFN-γ水平不全相同(P<0.05)。進(jìn)一步用SNK-q法進(jìn)行兩兩比較發(fā)現(xiàn)，AECOPD患者PBMC中僅加入抗CD3抗體后獲得的培養(yǎng)物中IFN-γ水平顯著低于sCOPD患者PBMC中僅加入抗CD3抗體及AECOPD患者PBMC中加入抗CD3抗體+抗CTLA-4抗體所獲得的培養(yǎng)物中IFN-γ水平，而AECOPD患者PBMC中加入抗CD3抗體+抗CTLA-4抗體所獲得的培養(yǎng)物中IFN-γ水平與sCOPD患者PBMC中僅加入抗CD3抗體所獲得的培養(yǎng)物中IFN-γ水平間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。同時(shí)，通過(guò)比較發(fā)現(xiàn)3組培養(yǎng)物的TNF-α水平不全相同(P<0.05)。進(jìn)一步兩兩比較發(fā)現(xiàn),AECOPD患者PBMC中僅加入抗CD3抗體后獲得的培養(yǎng)物中TNF-α水平顯著低于sCOPD患者PBMC中僅加入抗CD3抗體及AECOPD患者PBMC中加入抗CD3抗體+抗CTLA-4抗體所獲得的培養(yǎng)物中TNF-α水平，而AECOPD患者PBMC中加入抗CD3抗體+抗CTLA-4抗體所獲得的培養(yǎng)物中TNF-α水平與sCOPD患者PBMC中僅加入抗CD3抗體所獲得的培養(yǎng)物中TNF-α水平間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表3。

表2 兩組患者CTTLA-4+細(xì)胞比例分析

注：*表示W(wǎng)ilcoxon秩和檢驗(yàn)

表3 兩組患者PBMC經(jīng)不同方式培養(yǎng)后血清中IFN-γ、TNF-α水平分析

續(xù)表3 兩組患者PBMC經(jīng)不同方式培養(yǎng)后血清中IFN-γ、TNF-α水平分析

注：*表示對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)化后服從正態(tài)分布

3 討 論

有研究顯示，AECOPD的患者合并有細(xì)菌感染的比例高達(dá)50%，這常常導(dǎo)致病情復(fù)雜化并使患者治療難度增加，對(duì)患者病情的控制十分不利[8-9]。病原分離的結(jié)果提示，未分型流感嗜血桿菌、肺炎鏈球菌和莫拉克斯菌屬是造成AECOPD患者肺部感染的主要病原體[10-11]。值得注意的是，有研究報(bào)道口服未分型流感嗜血桿菌疫苗無(wú)法阻止AECOPD患者肺部受到未分型流感嗜血桿菌的感染；同時(shí)，AECOPD患者氣道浸潤(rùn)的大量活化T細(xì)胞同樣對(duì)AECOPD患者的肺部感染無(wú)能為力；而且經(jīng)痰培養(yǎng)確診的肺部合并不可分型流感嗜血桿菌(NTHI)感染的AECOPD患者對(duì)NTHI P6蛋白的淋巴增殖反應(yīng)低于不合并NTHI感染的COPD患者[12]。以上事實(shí)均說(shuō)明AECOPD患者的呼吸道免疫功能受到限制。雖有研究證實(shí)該現(xiàn)象與COPD患者急性加重期的Th1細(xì)胞功能障礙有關(guān)[13-14]，但是關(guān)于其中的機(jī)制性研究還比較匱乏。通過(guò)本次研究，可以說(shuō)明表面CTLA-4+細(xì)胞有限制AECOPD患者Th1細(xì)胞功能的作用。如果進(jìn)一步阻斷表面CTLA-4+的表達(dá)，Th1細(xì)胞功能將有所恢復(fù)并且血清中IFN-γ與TNF-α的水平均有顯著提高。

從sCOPD患者及AECOPD患者外周血PBMC中CTTLA-4+細(xì)胞比例分析結(jié)果可知，sCOPD患者細(xì)胞內(nèi)CTLA-4+細(xì)胞在Treg細(xì)胞及CD4+細(xì)胞的比例與AECOPD患者細(xì)胞內(nèi)CTLA-4+細(xì)胞在Treg細(xì)胞及CD4+細(xì)胞的比例十分接近；而表面CTLA-4+則不然，sCOPD患者表面CTLA-4+細(xì)胞在Treg細(xì)胞及CD4+細(xì)胞的比例分別為8.69%和1.08%；AECOPD患者表面CTLA-4+細(xì)胞在Treg細(xì)胞及CD4+細(xì)胞的比例分別為20.74%和2.31%，兩組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。因此，COPD患者急性加重期的Th1細(xì)胞功能障礙主要與表面CTLA-4+細(xì)胞相關(guān)，而非細(xì)胞內(nèi)CTLA-4+細(xì)胞，這與其他相關(guān)研究所得結(jié)論一致[6，15]。而且高比例的表面CTLA-4+也會(huì)造成AECOPD患者血清sTNFR1水平高于sCOPD患者。而細(xì)胞內(nèi)CTLA-4+通常與COPD患者呼吸道的長(zhǎng)期慢性炎癥相關(guān)，因此，在兩組間未見(jiàn)顯著差別。

從基因的角度來(lái)看，CTLA-4基因的剪切變異體可以使CTLA-4的跨膜異構(gòu)體及不能跨膜轉(zhuǎn)移的可溶性異構(gòu)體表達(dá)增加[16]。兩種異構(gòu)體均可由活性CD4+細(xì)胞誘導(dǎo)并抑制免疫反應(yīng)。由于本次研究所使用的抗CTLA-4抗體可以阻斷跨模性及可溶性兩種異構(gòu)體的免疫活性。因此，尚需進(jìn)一步使用針對(duì)兩種異構(gòu)體的特異性阻斷抗體進(jìn)行試驗(yàn)以獲得進(jìn)一步的結(jié)論。這也是下一步研究的重點(diǎn)。

本次研究結(jié)果顯示，IFN-γ的水平與CTLA-4+細(xì)胞比例呈反比例關(guān)系，在加入抗CTLA-4抗體的AECOPD組中IFN-γ的水平有顯著升高，提示抗CTLA-4抗體的加入可以恢復(fù)Th1細(xì)胞的免疫功能。因此，可以降低AECOPD患者肺部細(xì)菌性感染的風(fēng)險(xiǎn)，這一結(jié)論可以為COPD急性加重時(shí)患者的治療產(chǎn)生有益的提示。