袁曉嵐，汪琳姣，王 為，席 巍

(南通大學(xué)附屬海安醫(yī)院內(nèi)分泌科，江蘇南通 226600)

橋本甲狀腺炎(HT)是臨床最為常見的一種慢性淋巴細(xì)胞性甲狀腺炎(CLT)，其會(huì)導(dǎo)致患者甲狀腺細(xì)胞受損，從而發(fā)生甲狀腺功能減退(簡(jiǎn)稱甲減)[1]。今年來，隨著人們普遍食用含碘食鹽和生活方式的變化，HT的發(fā)病率呈現(xiàn)出逐年升高的趨勢(shì)，已經(jīng)成為原發(fā)性甲減最主要的致病原因，而且HT還與甲狀腺癌發(fā)病率的升高有關(guān)[2]。HT的發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，與環(huán)境因素、遺傳因素、自身免疫調(diào)節(jié)等眾多因素有關(guān)，特異性淋巴細(xì)胞在抗甲狀腺球蛋白(Tg) 自身免疫啟動(dòng)后會(huì)遷移至甲狀腺，使甲狀腺濾泡細(xì)胞(TFC)表達(dá)在干擾素-γ(IFN-γ)的誘導(dǎo)下表達(dá)大量可導(dǎo)致炎癥反應(yīng)進(jìn)一步被放大的組織相容性復(fù)合體(MHC) Ⅱ類分子，使甲狀腺組織被具有致活化作用的巨噬細(xì)胞、漿細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等大量浸潤(rùn)，自身免疫反應(yīng)被激活，導(dǎo)致甲狀腺細(xì)胞被破壞[3]。在這一免疫機(jī)制中，脂肪因子、細(xì)胞因子和淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子都被認(rèn)為發(fā)揮了重要的介導(dǎo)和調(diào)節(jié)作用。內(nèi)脂素是一種由脂肪細(xì)胞分泌的參與機(jī)體糖脂代謝過程的脂肪因子，有研究顯示其有可能還參與了HT患者的免疫調(diào)節(jié)過程[4]。維甲酸相關(guān)孤核受體α(RORα)是2型固有免疫淋巴細(xì)胞(ILC2)的特征性轉(zhuǎn)錄因子，研究指出,ILC2水平與HT患者Th2細(xì)胞活化狀態(tài)密切相關(guān)[5]。CD195、CD30為CD4+T淋巴細(xì)胞特異性表面因子，二者水平則與甲狀腺局部免疫紊亂情況有關(guān)[6]?；谏鲜鲅芯?，筆者則對(duì)血清內(nèi)脂素、細(xì)胞因子CD195、CD30及RORα mRNA水平與HT伴甲減至今的相關(guān)性進(jìn)行研究和探討，以進(jìn)一步明確HT發(fā)病的免疫學(xué)機(jī)制，進(jìn)而為臨床免疫學(xué)機(jī)制干預(yù)手段的選擇和應(yīng)用提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2016年3月至2017年12月在本院接受治療的54例HT伴臨床甲減患者、52例HT甲狀腺功能正常分別作為HT甲減組、HT功能正常組研究對(duì)象，選擇同期在本院進(jìn)行體檢的46名健康志愿者作為健康對(duì)照組。HT診斷標(biāo)準(zhǔn)：同時(shí)滿足以下3項(xiàng)條件即可確診：(1)甲狀腺彌漫性腫大，經(jīng)B超證實(shí)且無結(jié)節(jié)；(2)甲狀腺過氧化物酶抗體(TPOAb)、甲狀腺球蛋白抗體(TGAb)檢測(cè)呈陽性；(3)甲狀腺顯像可見不規(guī)則的稀疏和濃集區(qū)域。以血清游離三碘甲腺原氨酸(FT3)、游離甲狀腺素(FT4)水平低于正常低限值，總促甲狀腺激素(TSH)超過正常上限值確定為甲狀腺功能減退?；颊呔鶠槲唇邮苓^甲狀腺激素治療的首診患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)存在精神功能障礙者；(2)不符合上述診斷標(biāo)準(zhǔn)者；(3)已接受過相關(guān)治療，可能影響本研究結(jié)果者；(4)心電圖存在明顯心肌缺血改變或伴有嚴(yán)重缺血性心臟病者；(5)存在腎上腺皮質(zhì)功能異常者；(6)合并嚴(yán)重肝、腎功能疾病者；(7)孕婦及哺乳期者。健康對(duì)照組志愿者則無高血壓、糖尿病、冠心病、心瓣膜病呼吸系統(tǒng)疾病、神經(jīng)核精神障礙、腫瘤、甲狀腺疾病、自身免疫性疾病及家族史。HT甲減組中，男15例，女39例；年齡20～70歲，平均(42.15±4.63)歲。HT功能正常組中，男14例，女38例；年齡20～70歲，平均(41.96±5.02)歲。健康對(duì)照組中，男10例，女36例；年齡20～70歲，平均(43.01±4.07)歲。3組研究對(duì)象性別構(gòu)成、年齡比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，入組患者及健康志愿者知情并簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1血清甲狀腺功能及抗體檢測(cè) 抽取所有患者和健康志愿者的清晨空腹靜脈血，靜置30 min后離心機(jī)3 000 r/min離心10 min，分離獲取血清，置于-20 ℃冰箱中保存待測(cè)。血清FT3、FT4、總?cè)饧紫僭彼?TT3)、總甲狀腺素(TT4)、TSH和血清TGAb、TPOAb、促甲狀腺激素受體抗體(TRAb)的檢測(cè)均采用電化學(xué)發(fā)光免疫分析法進(jìn)行，檢測(cè)儀器為德國(guó)羅氏診斷有限公司的Cobase 411全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀，配套試劑盒及質(zhì)控血清均來自于羅氏公司，嚴(yán)格按照說明書要求進(jìn)行操作。

1.2.2細(xì)胞因子CD30、CD195檢測(cè) 抽取所有患者和健康志愿者的外周血，應(yīng)用磷酸鹽緩沖液(PBS)以1∶1比例進(jìn)行稀釋，取含有等體積淋巴細(xì)胞分離液(上海試劑二廠)的圓底離心管，2 000 r/min離心15 min后收集單個(gè)核細(xì)胞層，用Hank′s液洗3次，1 500 r/min離心5 min。加入RPMI 1640培養(yǎng)液(美國(guó)GibcoBRL公司)調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為1×106/mL，加入PHA，調(diào)節(jié)終質(zhì)量濃度為100 μg/mL，放置于37 ℃、50 mL/CO2孵箱中培養(yǎng)，48 h后收集細(xì)胞，檢測(cè)CD30和CD195細(xì)胞。用PBS液對(duì)收集的細(xì)胞進(jìn)行洗滌重懸，加入藻紅蛋白(PE)標(biāo)記的鼠抗人CD30(深圳晶美生物工程有限公司)和異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的鼠抗人CD195(深圳晶美生物工程有限公司)，以不加抗體的標(biāo)本陰性對(duì)照。吹吸混勻后置于4 ℃下孵育45 min，PBS液洗滌2次，1 000 r/min離心10 min，殘留液體吸盡，沉淀彈散后在各管中加入1%多聚甲醛PBS 400 μL固定，保存在4 ℃冰箱中，12 h內(nèi)應(yīng)用FACS Scan流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)檢測(cè)CD30、CD195陽性細(xì)胞百分比。

1.2.3RORγ mRNA表達(dá)水平檢測(cè) 收集外周血單個(gè)核細(xì)胞后用PBS 10 mL洗滌2次，按照Trizol試劑盒說明書進(jìn)行總RNA提取。在外周血單個(gè)核細(xì)胞中加入總RNA提取試劑Trizol 1 mL，吹打混勻后，室溫下放置30 min。加入預(yù)冷氯仿200 μL，充分震蕩15 s，室溫下放置20 min，4 ℃下3 000 r/min離心15 min，收集上層水相，在其中加入異丙醇500 μL，混勻，室溫下放置10 min。4 ℃下3 000 r/min離心10 min，取下層沉淀用75%無水乙醇1 mL洗滌，4 ℃下2 000 r/min離心10 min，取下層沉淀，室溫下干燥至半透明狀，用無RNA酶的10 μL DEPC水溶解細(xì)胞，提取總RNA，采用Ur-2401紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA樣品的濃度和純度。采用半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(semiRT-PCR) 法測(cè)定外周血RORαmRNA表達(dá)水平。應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行cDNA合成，操作根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行，總RNA提取試劑盒和反轉(zhuǎn)錄試劑盒均購買自大連寶生物工程有限公司。聚合酶聯(lián)反應(yīng)中應(yīng)用Primer 5.0進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，RORα、β-actin mRNA的引物序列為RORα：上游為CTG ACG AGG ACA GGA GTA GG，下游為GTG CGC AGA CAG AGC TAT TC，產(chǎn)物長(zhǎng)度為214 bp；人β-actin：上游為5′-TCT ACA ATG AGC TGC GTG TGG-3′，下游，5′-GGA ACC GCT CAT TGC CAA TG-3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度498 bp。引物序列由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成。PCR反應(yīng)條件：94 ℃下預(yù)變性5 min；94 ℃下變性5 s，59 ℃下RORα退火30 s，58 ℃下β-actin退火30 s，72 ℃下延伸30 s，循環(huán)共計(jì)35個(gè)；72 ℃下保溫5 min。取5 μLPCR產(chǎn)進(jìn)行1%瓊脂糖電泳和溴化乙啶染色，應(yīng)用BIO-RAD CheniDOC XRS圖像分析系統(tǒng)讀取條帶灰度值，以目的基因和βactin灰度值比值表示mRNA表達(dá)的相對(duì)值。

2 結(jié) 果

2.1各組甲狀腺功能指標(biāo)比較 HT甲減組的血清FT3、FT4、TT3、TT4水平均顯著低于健康對(duì)照組和HT功能正常組,HT甲減組TSH則顯著高于健康對(duì)照組和HT功能正常組(P<0.05)，HT功能正常組與健康對(duì)照組間FT3、FT4、TT3、TT4比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

2.2各組自身抗體水平比較 HT甲減組TRAb、TPOAb、TGAb均顯著高于健康對(duì)照組和HT功能正常組，HT功能正常組的TRAb、TPOAb、TGAb也顯著高于健康對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

2.3各組血清內(nèi)脂素、細(xì)胞因子及RORαmRNA表達(dá)水平比較 HT甲減組血清內(nèi)脂素、 CD195和CD30 陽性百分比及RORαmRNA表達(dá)水平均顯著高于HT功能正常組和健康對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且HT功能正常組和健康對(duì)照組血清內(nèi)脂素、 CD195和CD30 陽性百分比及RORαmRNA表達(dá)水平比較差異也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表3。

2.4相關(guān)性分析 HT甲減組患者血清內(nèi)脂素、CD30、CD195陽性百分比、RORαmRNA表達(dá)水平均與TSH、TRAb、TGAb、TPOAb呈明顯正相關(guān)，與TT4呈明顯負(fù)相關(guān)(P<0.05)，見表4。

表1 各組甲狀腺功能指標(biāo)比較±s)

注：與健康對(duì)照組比較，*P<0.05；與HT功能正常組比較，#P<0.05

表2 各組自身抗體水平比較±s)

注：與健康對(duì)照組比較，*P<0.05；與HT功能正常組比較，#P<0.05

表3 各組血清內(nèi)脂素、細(xì)胞因子及RORαmRNA表達(dá)水平比較±s)

注：與健康對(duì)照組比較，*P<0.05；與HT功能正常組比較，#P<0.05

表4 Pearson相關(guān)性分析

3 討 論

HT是臨床常見的一種可導(dǎo)致甲狀腺功能亢進(jìn)或減退的甲狀腺疾病，可見甲狀腺腫大或結(jié)節(jié)，甲狀腺持續(xù)免疫炎癥持續(xù)進(jìn)展，最終可導(dǎo)致甲減，出現(xiàn)包括畏寒、疲勞、甲狀腺腫痛、心率減慢、便秘、抑郁等在內(nèi)的臨床表現(xiàn)，或并發(fā)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、惡性貧血、干燥綜合征等并發(fā)癥，甚至發(fā)生癌變，女性患者多伴有受孕和懷孕困難[7]。流行學(xué)研究顯示，HT是導(dǎo)致甲狀腺功能減退的主要病因，其發(fā)病率約為0.1%～10.0%，以女性患者更為常見[8]。HT目前的發(fā)病機(jī)制尚不明確，臨床采取的治療方式主要為甲狀腺激素類藥物替代療法，雖然該種療法可明顯緩解患者的甲狀腺腫大，改善其甲狀腺功能，但也存在不良反應(yīng)多、停藥易復(fù)發(fā)等不足，而且無法完全糾正患者的甲狀腺功能減退，隨著病情發(fā)展，多數(shù)患者最終往往需接受手術(shù)治療[9]。因此對(duì)HT發(fā)病機(jī)制的探討有可能為疾病的治療提供新的途徑。

HT患者早期多無臨床癥狀,隨病程進(jìn)展,出現(xiàn)彌漫性甲狀腺腫大,早期可伴甲狀腺功能亢進(jìn)(簡(jiǎn)稱甲亢),晚期伴甲減。其中甲亢期患者血清TSH輕微升高，血清TT3、TT4及自身抗體TPOAb、TGAb等陽性。后期有甲狀腺組織不斷受到破壞而萎縮，最終發(fā)生甲減，其血清TSH水平顯著升高，F(xiàn)T3、FT4、TT3、TT4水平降低，且血清中TPOAb、TGAb、TRAb持續(xù)陽性[10]。本研究結(jié)果顯示,HT甲減組的血清FT3、FT4、TT3、TT4水平均顯著低于健康對(duì)照組和HT功能正常組,TSH則顯著高于健康對(duì)照組和HT功能正常組，而HT功能正常組患者的相關(guān)甲狀腺激素與健康對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；比較其自身抗體水平可見HT甲減組TRAb、TPOAb、TGAb均顯著高于健康對(duì)照組和HT功能正常組，HT功能正常組也顯著高于健康對(duì)照組。提示甲狀腺功能正常的HT患者甲狀腺激素水平變化不大，而無論甲狀腺功能減退還是正常，HT患者的自身抗體水平均明顯升高。高表達(dá)水平的自身抗體可通過補(bǔ)體、抗體依賴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用等途徑對(duì)甲狀腺濾泡產(chǎn)生損傷作用，從而最終導(dǎo)致甲狀腺功能減退[11]。

HT屬于器官特異性自身免疫性疾病，多種機(jī)制參與其發(fā)病過程。B細(xì)胞的活化是導(dǎo)致甲狀腺產(chǎn)生抗體的主要原因，而Th2細(xì)胞在該過程中發(fā)揮了重要的輔助作用。ILC2是一種固有淋巴細(xì)胞，其通過分泌和釋放2型免疫應(yīng)答細(xì)胞因子參與了維持Th2優(yōu)勢(shì)分化狀態(tài)的過程，其還對(duì)B細(xì)胞釋放IgE抗體具有促進(jìn)作用。而RORα則是特征性的ILC2轉(zhuǎn)錄因子，其對(duì)于ILC2分化和功能的維持意義重大[6]。有學(xué)者對(duì)HT患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中RORαmRNA的表達(dá)水平進(jìn)行觀察，結(jié)果顯示，相對(duì)于健康對(duì)照者，HT患者RORα表達(dá)水平顯著升高，其ILC2細(xì)胞活性升高，進(jìn)一步相關(guān)性分析結(jié)果顯示，RORαmRNA表達(dá)水平與血清自身抗體水平呈現(xiàn)明顯正相關(guān)，其指出RORα的表達(dá)可通過影響ILC2活性來進(jìn)一步影響HT患者自身抗體的產(chǎn)生[12]。本研究結(jié)果顯示，HT甲減組和HT功能正常組患者的外周血單個(gè)核細(xì)胞RORαmRNA表達(dá)水平顯著高于健康對(duì)照組，且HT功能正常組也顯著高于健康對(duì)照組，Pearson相關(guān)性分析則顯示HT甲減組患者RORαmRNA表達(dá)水平均與TSH、TRAb、TGAb、TPOAb呈明顯正相關(guān)，與TT4呈明顯負(fù)相關(guān)。提示RORα的表達(dá)水平與HT患者甲狀腺功能減退和自身抗體水平密切相關(guān)。

CD30、CD195是CD4+T淋巴細(xì)胞的特異性表面因子，其中CD30是Th2細(xì)胞的優(yōu)勢(shì)細(xì)胞因子，CD195是Th1細(xì)胞的優(yōu)勢(shì)細(xì)胞因子，二者表達(dá)水平的變化可對(duì)甲狀腺局部Th1、Th2平衡產(chǎn)生影響，可反映出甲狀腺局部免疫狀態(tài)。作為Th2細(xì)胞的代表性細(xì)胞因子，CD30水表達(dá)水平的升高提示體液免疫活躍，在哮喘、Graves病患者中均可見CD30的優(yōu)勢(shì)表達(dá)[13]。CD195又名CCR5，屬于調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)趨化因子受體家族，主要表達(dá)于單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞中，參與免疫狀態(tài)穩(wěn)定的維持。有研究指出，CD195的高水平表達(dá)是誘發(fā)HT細(xì)胞免疫的重要因素[14]。本研究結(jié)果顯示，HT甲減組和HT功能正常組患者的CD30、CD195陽性百分比均顯著高于健康對(duì)照組，且HT功能正常組也顯著高于健康對(duì)照組，Pearson相關(guān)性分析則顯示HT甲減組患者CD30、CD195陽性百分比均與TSH、TRAb、TGAb、TPOAb呈明顯正相關(guān)，與TT4呈明顯負(fù)相關(guān)。提示HT患者的甲狀腺功能減退與CD30、CD195異常表達(dá)而導(dǎo)致細(xì)胞免疫活躍有關(guān)。

內(nèi)脂素是新近發(fā)現(xiàn)的一種具有模擬胰島素作用的脂肪因子，同時(shí)也是一個(gè)促炎癥反應(yīng)因子，具有炎癥和免疫特性，在人體獲得性免疫和固有免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)中具有非常重要的作用。內(nèi)脂素可對(duì)樹突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的活化狀態(tài)產(chǎn)生調(diào)控，其可誘導(dǎo)T細(xì)胞分化為Th2細(xì)胞，使輔助B細(xì)胞成熟的白介素(IL)-4、IL-5、IL-6等釋放增多，從而促進(jìn)自身抗體產(chǎn)生，介導(dǎo)體液免疫。有研究指出，內(nèi)脂素水平與甲狀腺功能密切相關(guān)，當(dāng)甲狀腺功能減退時(shí)，體內(nèi)脂肪組織蓄積，脂肪細(xì)胞合成分泌內(nèi)脂素增加，其血清濃度相應(yīng)升高，而且其血清濃度與甲狀腺功能異?；颊哐寮谞钕偌に厮接嘘P(guān)[15]。本研究結(jié)果顯示，HT甲減組和HT功能正常組患者的血清內(nèi)脂素水平顯著高于健康對(duì)照組，且HT功能正常組也顯著高于健康對(duì)照組，Pearson相關(guān)性分析則顯示HT甲減組患者內(nèi)脂素與TSH、TRAb、TGAb、TPOAb呈明顯正相關(guān)，與TT4呈明顯負(fù)相關(guān)。提示內(nèi)脂素水平的升高與HT患者甲狀腺激素水平的變化和自身抗體水平水平升高有關(guān)，但有關(guān)其在HT甲狀腺功能減退中的價(jià)值仍需進(jìn)一步研究明確。

綜上所述，HT甲減患者的血清內(nèi)脂素、細(xì)胞因子CD30、CD195陽性百分比及RORα表達(dá)水平均顯著升高，其與患者的甲狀腺功能及自身抗體水平具有一定的相關(guān)性，其作用可能是通過影響調(diào)節(jié)性 T 細(xì)胞趨化因子受體水平和Th2 細(xì)胞因子表達(dá)，導(dǎo)致自身免疫反應(yīng)被激活，引起甲狀腺細(xì)胞破壞，從而最終導(dǎo)致患者發(fā)生甲狀腺功能減退。