徐哲,劉亞軍, 鄢程程,丁藝,何婷婷,張福,高清川

(廣元市中心醫(yī)院，四川廣元628000)

據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球的兒童哮喘發(fā)病率逐年上升[1]。根據(jù)2014年全球哮喘防治創(chuàng)議委員會(huì)調(diào)查研究表明[2]，≤5歲兒童哮喘的病因復(fù)雜，其發(fā)病的病理生理學(xué)機(jī)制亦尚未徹底清楚，可能與內(nèi)分泌因素、神經(jīng)、免疫精神和遺傳學(xué)背景等密切相關(guān)。目前的觀點(diǎn)[3]是遺傳和環(huán)境因素相互作用共同導(dǎo)致哮喘的發(fā)展和演變。國(guó)外早期的全基因組關(guān)聯(lián)研究(GWAS)[4]已確定多個(gè)染色體位點(diǎn)與哮喘相關(guān)，且多項(xiàng)關(guān)于候選基因變異與哮喘風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性研究[5]提出了多種易感基因。最新GWAS研究[6]發(fā)現(xiàn)，白介素1受體1(Interleukin 1 receptor-like 1, IL1RL1)基因是哮喘的易感基因。進(jìn)一步研究[7]發(fā)現(xiàn)，漢族哮喘患者血清L1RL1水平升高，且該易感基因的RS1558641位點(diǎn)與過敏性哮喘發(fā)生發(fā)展有關(guān)。我們前期基于Hapmap數(shù)據(jù)庫(kù)(http：//hapmap.ncbi.nlm.nih.gov/)獲得的IL1RL1基因組遺傳變異資料，采用Haploview軟件確定其多態(tài)位點(diǎn)的分布頻率，利用Tagger功能，按照在中國(guó)人群中最下等位基因頻率>5%，并且與區(qū)段內(nèi)其他單核苷酸多態(tài)性(SNP)的連鎖不平衡系數(shù)均>0.8的原則，最終篩選出RS1041973、RS1020893位點(diǎn)可能與過敏性哮喘有關(guān)。但嬰幼兒哮喘與IL1RL1基因中RS1041973、RS1020893位點(diǎn)的相關(guān)性研究較少。我們觀察了支氣管哮喘患兒IL1RL1基因RS1041973、RS1020893位點(diǎn)的SNP，旨在為嬰幼兒支氣管哮喘的病理生理學(xué)機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 隨機(jī)選取2012年1月～2015年1月在廣元市中心醫(yī)院兒科門診及住院確診為支氣管哮喘[8]的患兒86例為哮喘組，其中男49 例，女37例，年齡5月～3(1.49 ± 0.70) 歲。同時(shí)隨機(jī)選取同時(shí)體檢的健康兒童100例為對(duì)照組，其中男50例，女50例，年齡 3 月～3 (1.52 ± 0.85)歲。兩組年齡、性別比例具有可比性。兩組納入對(duì)象均排除既往有心肺、肝病或腎病疾患，過敏性疾患及其他變態(tài)反應(yīng)性疾患史，免疫性疾病史和慢性疾病史，近四周無(wú)感染及服藥史。本研究通過廣元市中心醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，納入患兒家長(zhǎng)均簽署知情同意書。

1.2 兩組IL1RL1基因RS1041973、RS10208293位點(diǎn)基因型及等位基因分析方法 抽取兩組空腹靜脈血2 mL，3 000 r/min離心5 min。采用天根血液DNA提取試劑盒(DP348)，參照試劑盒說(shuō)明書，提取血液DNA，-70 ℃保存?zhèn)溆谩＠锰结?、引物找到其IL1RL1基因RS1041973、RS10208293位點(diǎn)并對(duì)其進(jìn)行擴(kuò)增，采用ARMS-qPCR法對(duì)其基因位點(diǎn)行基因分型檢測(cè)。設(shè)計(jì)引物、探針及利用Primer Premer6軟件設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物由上海捷瑞生物公司合成，所有引物及探針可見表1、2。

表1 IL1RL1基因RS1041973、RS10208293位點(diǎn)基本信息、引物及探針序列

表2 IL1RL1基因RS1041973、RS10208293位點(diǎn)測(cè)序引物序列

熒光定量PCR結(jié)合特異性ARMS引物和探針，檢測(cè)IL1RL1基因RS1041973、RS10208293位點(diǎn)的基因型以及等位基因的表達(dá)情況。熒光定量PCR 反應(yīng)條件為:95 ℃ 3 min， 40個(gè)循環(huán)：94℃ 10 s，60 ℃ 40 s。RS1041973 位點(diǎn)A/C基因型測(cè)序結(jié)果包括AA、AC、CC三種基因型，RS10208293位點(diǎn)A/G基因型測(cè)序結(jié)果包括AA、AG、GG三個(gè)基因型。

1.3 兩組血清IL1RL1、IgE檢測(cè) 采用ELISA法。抽取兩組空腹靜脈血2 mL，3 000 r/min離心5 min，取血清。人血IL1RL1定量免疫試劑盒購(gòu)自上海西唐生物科技有限公司，參照其試劑盒說(shuō)明檢測(cè)兩組血清IL1RL1。人IgE定量免疫試劑盒購(gòu)自上海西唐生物科技有限公司，參照其試劑盒說(shuō)明檢測(cè)兩組血清IgE。

2 結(jié)果

哮喘組IL1RL1基因RS1041973位點(diǎn)基因型AA、AC、CC的分布頻率分別為3.5%(3/86)、23.3%(20/86)、73.2%(63/86)，等位基因A、C的分布頻率分別為15.2%(26/172)、84.8%(146/172)；對(duì)照組分別為8.0%(8/100)、26.0%(26/100)、66.0%(66/100)、21%(42/200)、79%(158/200)；兩組AC、CC基因型分布頻率及等位基因A、C的分布頻率差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。與RS1041973位點(diǎn)基因型AA基因人群比較，RS1041973位點(diǎn)AC、CC基因型的個(gè)體患哮喘的風(fēng)險(xiǎn)性增加(校正OR=1.769，2.212；95%CI：0.47～6.655，0.637～7.687)；且攜帶C等位基因的個(gè)體患哮喘的危險(xiǎn)度是A基因的1.506倍(95%CI：0.726～3.126，P<0.05)。

哮喘組IL1RL1基因RS10208293位點(diǎn)基因型AA、AG、GG的分布頻率分別為4.6%(4/86)、25.6%(22/86)、69.8%(60/86)，等位基因A、G的分布頻率分別為17.4%(30/172)、82.6%(142/172)；對(duì)照組分別為7.0%(7/100)、29.0%(29/100)、64.0%(64/100)、21.5%(43/200)、78.5%(157/200)；兩組AG、GG基因型分布頻率及等位基因A、G的分布頻率差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。與RS10208293位點(diǎn)基因型AA基因人群比較，RS10208293位點(diǎn)AG、GG基因型的個(gè)體患哮喘的風(fēng)險(xiǎn)性增加(校正OR=1.255，1.531；95%CI：0.355～-4.442，0.463～ 5.067)；且攜帶G等位基因的個(gè)體患哮喘的危險(xiǎn)度是A基因的1.36倍(95%CI：0.673～2.749，P<0.05)。

哮喘組、對(duì)照組血清IL1R1分別為(78.32±53.32)、(67.36 ±36.73)ng/mL(P<0.05)；哮喘組、對(duì)照組血清IgE分別為(140.87±65.32)、(87.84±45.22)ng/mL(P<0.05)。

3 討論

炎癥免疫反應(yīng)在支氣管哮喘發(fā)病中的作用機(jī)制一直是備受關(guān)注的焦點(diǎn)。研究[9]發(fā)現(xiàn),Th2細(xì)胞在支氣管哮喘的炎癥反應(yīng)過程中發(fā)揮了及其重要的作用。IL1RL1基因定位于2號(hào)染色體上，最早從BALB/c-3T3細(xì)胞系中得到IL1RL1基因，其結(jié)構(gòu)與IL-1受體(IL-1R)相似，具有 Toll/IL-1R的結(jié)構(gòu)域，同時(shí)主要表達(dá)于肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞、支氣管上皮細(xì)胞、肥大細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞和TH2細(xì)胞。以往研究[10]證實(shí)在不同人群中 IL1RL1 基因與哮喘的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)。

IL1RL1 基因編碼位于 TH2 細(xì)胞和調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞受體。IL1RL1可特異性識(shí)別并結(jié)合IL-33，兩者相互作用，借助IL-1 輔助受體蛋白( IL-1RAcP)而形成IL-33/ IL1RL1復(fù)合物[11]。胞膜上IL1RL1和 IL-1RAcP 可組合形成異二聚體，通過與IL-33 結(jié)合，將信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)至胞內(nèi)并激活下游絲裂原活化蛋白激酶( MAPKK) ，導(dǎo)致 NF-κB 從復(fù)合物中釋放出來(lái)，最終激活Th2 細(xì)胞因子，促Th2細(xì)胞因子過表達(dá)，啟動(dòng)炎癥反應(yīng)的發(fā)生[13]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在支氣管哮喘患兒中IL-33的過表達(dá)和IL1RL1過表達(dá)同時(shí)存在，進(jìn)一步證實(shí)了IL-33/ IL1RL1復(fù)合物激活的信號(hào)通路在哮喘中具有舉足輕重的作用。IL-33/IL1RL1通路多態(tài)性與哮喘表型相關(guān)聯(lián)。以上研究結(jié)果均提示，阻斷IL-33/IL1RL1 信號(hào)通路可減少TH2細(xì)胞因子的激活，減輕炎癥反應(yīng)以達(dá)到治療哮喘的效果。

支氣管哮喘是一種氣道慢性炎癥，TH2細(xì)胞因子的活化是其病理生理學(xué)基礎(chǔ)[13]，IL-33/ IL1RL1復(fù)合物可以將信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)至胞內(nèi)激活MAPKK，導(dǎo)致NF-κB的釋放，激活Th2 細(xì)胞因子，促進(jìn)Th2細(xì)胞因子過表達(dá)，從而導(dǎo)致Th2高表達(dá)，Th2高表達(dá)型通常表現(xiàn)為血清IgE的增高[14]，從而導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的發(fā)生。本研究發(fā)現(xiàn)，哮喘組血清IL1RL1和IgE的水平明顯高于對(duì)照組，提示IL1RL1表達(dá)與血清IgE表達(dá)可能具有一定的關(guān)系。

RS1041973 位點(diǎn)位于IL1RL1基因的三號(hào)外顯子上，為非同義突變，其突變可導(dǎo)致細(xì)胞膜外部區(qū)域的IL1RL1蛋白特定位點(diǎn)的谷氨酸突變?yōu)楸彼?，其結(jié)果是使負(fù)電荷的氨基酸突變?yōu)橹行园被?，從而?dǎo)致在細(xì)胞外免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域的構(gòu)象改變[15]。RS1041973位點(diǎn)A>C,在哮喘患兒中分布增多，且IL1RL1蛋白的血清含量明顯增多，同樣也說(shuō)明該位點(diǎn)的突變可能與IL1RL1基因的過表達(dá)相關(guān)，過度激活I(lǐng)L-33/ IL1RL1信號(hào)通路，導(dǎo)致呼吸道的過敏反應(yīng)，進(jìn)而引發(fā)嬰幼兒的哮喘發(fā)作。RS10208293位點(diǎn)位于IL1RL1基因的內(nèi)含子區(qū)域，實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)的A>G,也與IL1RL1表達(dá)量增高相關(guān)，推測(cè)可能的原因?yàn)樵撐稽c(diǎn)與調(diào)節(jié)該基因轉(zhuǎn)錄翻譯的位點(diǎn)存在連鎖效應(yīng)，但進(jìn)一步的分子機(jī)制有待研究。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，哮喘組IL1RL1基因RS1041973位點(diǎn)基因型AC、CC的分布頻率高。RS1041973的基因型位點(diǎn)中的AA、AC、CC這三種基因型，AA基因型不增加哮喘發(fā)生危險(xiǎn)，AA基因型的OR值為1，而AC、CC基因型均可增加哮喘發(fā)生的危險(xiǎn)性，在RS1041973的等位基因型A和C中，A等位基因不能使哮喘的患病風(fēng)險(xiǎn)增高，A等位基因的OR值為1，而C等位基因可能提示患病風(fēng)險(xiǎn)增高，說(shuō)明與RS1041973位點(diǎn)基因型AA基因人群比較，RS1041973位點(diǎn)AC、CC基因型的個(gè)體患哮喘的風(fēng)險(xiǎn)性增加；且攜帶C等位基因的個(gè)體患哮喘的危險(xiǎn)度是A基因的1.506倍。與對(duì)照組比較，哮喘組IL1RL1基因RS1041973位點(diǎn)基因型AG、GG的分布頻率高。在RS102082933的基因型位點(diǎn)中的AA、AG、GG這三種基因型，AA基因型不能增加哮喘發(fā)生的危險(xiǎn)性，AA基因型的OR值為1，而 AG 和GG 基因型均能增加哮喘發(fā)生的危險(xiǎn)性，RS102082933位點(diǎn)等位基因型A和G中，A等位基因不能使哮喘的患病風(fēng)險(xiǎn)增高，A等位基因的OR值為1，而G等位基因可能提示患病風(fēng)險(xiǎn)增高，提示與RS10208293位點(diǎn)基因型AA基因人群比較，RS10208293位點(diǎn)AG、GG基因型的個(gè)體患哮喘的風(fēng)險(xiǎn)性增加；且攜帶G等位基因的個(gè)體患哮喘的危險(xiǎn)度是A基因的1.36倍。

綜上所述，支氣管哮喘患兒IL1RL1基因RS1041973位點(diǎn)基因型AC、CC的分布頻率高，C等位基因突變頻率高；RS10208293位點(diǎn)基因型AG、GG的分布頻率高，G等位基因突變頻率較高。IL1RL1基因RS1041973位點(diǎn)A/C的C等位基因、RS10208293位點(diǎn)A/G的G等位基因可能與支氣管哮喘的易感性有關(guān)。支氣管哮喘患兒血清IL1RL1、IgE均水平增高，IL1RL1、IgE可能通過過度激活TH2細(xì)胞因子，在支氣管哮喘的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。