許禎，倪雅麗，肖曼，杜冠魁

(1 海南醫(yī)學院熱帶醫(yī)學與檢驗醫(yī)學院，海南?？?71199;2 海南醫(yī)學院藥學院;3 海南醫(yī)學院生物化學與分子生物學教研室)

糖尿病發(fā)病率呈世界性的逐年上升趨勢[1]。目前，糖尿病已成為發(fā)達國家繼心血管病和腫瘤之后的第三大非傳染性疾病，糖尿病可導致眼、腎、神經(jīng)、心臟、血管等組織器官的慢性進行性病變，給社會帶來巨大的經(jīng)濟負擔[1]。糖尿病腎病(DN)是嚴重的糖尿病微血管并發(fā)癥之一。DN早期無明顯臨床癥狀，但病情即可出現(xiàn)腎臟血流動力學異常，表現(xiàn)為腎小球高灌注和高濾過,腎血流量和腎小球濾過率(GFR)升高，且增加蛋白攝入后各指標升高程度更明顯[1]。近年研究[2]表明，腸道菌群的改變與肥胖、DN的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。終末期DN患者的腸道優(yōu)勢菌群比例失調(diào)，雙歧桿菌屬、乳酸桿菌屬和糞桿菌屬等益菌群數(shù)量明顯減少，腸桿菌科細菌、腸球菌屬細菌等有害菌群數(shù)量明顯增多，導致患者血液炎癥因子水平升高，有利于體內(nèi)微炎癥狀態(tài)形成[3]。纈沙坦是一種血管緊張素Ⅱ(AT)受體拮抗劑，可降低腎小球?qū)Φ鞍椎耐ㄍ感?，延緩DN患者的腎功能衰竭[4]。但纈沙坦治療DN的具體作用機制目前尚不明確。2016年1月～2017年6月，我們觀察了纈沙坦灌胃的DN小鼠腸道菌群的變化，并分析其腸道菌群多樣性，旨在為纈沙坦治療DN的臨床應用提供理論依據(jù)。現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 動物、藥物、試劑及儀器 7只8周齡小鼠，雌雄不限，體質(zhì)量(23.62±1.35)g; 14只周齡8周雄性DN模型(db/db)小鼠,體質(zhì)量(30.28±1.47)g;購自南京模式動物研究所。纈沙坦分散片(山東益健藥業(yè)有限公司)，葡萄糖測定試劑盒(葡萄糖氧化酶法)，小鼠尿白蛋白(MAU)，ELISA檢測試劑盒，小鼠尿素氮 (BUN)ELISA試劑盒酶標儀、制冰機、冷凍離心機、超凈工作臺、注射器(1 mL)、96孔酶標板、移液搶與槍頭等。

1.2 動物分組及頡沙坦灌胃方法 將14只db/db小鼠隨機分為A、B 兩組，A組每天纈沙坦 50 mg/kg灌胃，B組等量生理鹽水灌胃，另取7只正常小鼠為對照組，每天灌胃等量生理鹽水。三組均灌胃8周。

1.3 各組小鼠腎功能指標觀察 灌胃后取各組小鼠，測定體質(zhì)量，尾部靜脈取血，GOD-POD法測定血糖。收集各組小鼠24 h尿液，ELISA法檢測小鼠尿素氮 (BUN)ELISA試劑盒酶標儀測定尿白蛋白和尿素氮，采用南京建成生物工程研究所尿白蛋白試劑盒，所有操作均嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.4 各組小鼠腸道菌群種屬及其生物多樣性分析 收集各組0.2 g糞便標本，采用QiaAmp Mini DNA-Isolation kit(德國Qiagen公司)提取細菌DNA，所有操作均嚴格按說明書進行。對提取細菌DNA進行高通量測序：以總DNA為模板，進行PCR擴增測序，引物序列為上游引物3′-GCCAGCAGCCGCGGTAA-5′；下游引物3′-CCGTCAATTYYTTTRAGTTT-5′。測序結(jié)果分析：對細菌種屬行PCoA分析，A、B組小鼠腸道菌群存在顯著的分離效應，B組與對照組腸道菌群存在顯著區(qū)別。進一步通過聚類分析將細菌進行分類,除db/db2，其余6個B組小鼠腸道菌群可聚為一類；除db/db-val6，其余6個A組小鼠腸道菌群可聚為一類。測算各組小鼠腸道細菌種屬OTU指數(shù)。根據(jù)序列的相似性(本分析中閾值設定為97%)，將有效序列歸為多個操作分類單元(OTU)，并將OTU中全部序列與相關(guān)數(shù)據(jù)庫進行比對，找出與之最相近且可信度達80%以上的細菌種屬信息，采用QIIME軟件分析測序結(jié)果[5]。通過Chao1算法計算各組小鼠腸道菌群辛普森(Simpson)、香農(nóng)(Shannon)指數(shù)，分析腸道菌群多樣性。Shannon指數(shù)越大,生物多樣性越高。Shannon指數(shù)描述種的個體出現(xiàn)紊亂和不確定性，不確定性越高說明生物多樣性越高。綱、種屬水平分析各組小鼠腸道菌群的相對豐度。

2 結(jié)果

灌胃后各組小鼠體質(zhì)量、血糖、尿白蛋白、尿素氮水平比較見表1。

表1 灌胃后各組小鼠體質(zhì)量、血糖、尿白蛋白、尿素氮水平比較

注：與對照組比較，*P<0.05;與B組比較，#P<0.05。

各組小鼠腸道菌群OTU指數(shù)、Chao1指數(shù)、Simpson指數(shù)和Shannon指數(shù)比較見表2。

表2 各組小鼠腸道菌群OTU指數(shù)、Chao1指數(shù)、Simpson指數(shù)和Shannon指數(shù)比較

注：與對照組比較，*P<0.05;與B組比較，#P<0.05。

綱水平上各組小鼠腸道菌群的相對豐度比較見表3。

表3 綱水平上各組小鼠腸道菌群相對豐度比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與B組比較，#P<0.05。

種屬水平上各組小鼠腸道菌群相對豐度比較見表4。

3 討論

正常成人腸道內(nèi)細菌總重量可達1～1.5 kg，其中益生菌為人體產(chǎn)生多種有益物質(zhì)，幫助機體維持代謝平衡，從而保護人類健康[6]。腸道菌群定植于腸道中，通過其代謝產(chǎn)物，菌體蛋白及其活力影響著人體的代謝、免疫等多個方面，與疾病的發(fā)生息息相關(guān)[7]。很多因素例如抗生素、應激、輻射、腸蠕動改變及飲食變化等都可引起腸道菌群結(jié)構(gòu)改變、細菌代謝活性變化或菌群在局部分布變化而引起的失衡狀態(tài)[6]。在疾病的狀態(tài)下，腸道菌群的多樣性會發(fā)生改變。研究[8]表明，結(jié)直腸癌患者腸道菌群的多樣性相對較低。腸道菌群失調(diào)在結(jié)直腸癌及結(jié)直腸腺瘤性息肉患者中表現(xiàn)出顯著性差異[9]。厚壁菌門/擬桿菌門的比值增加與肥胖及糖尿病腎病的發(fā)生密切相關(guān)。糖尿病腎病患者腸道菌群結(jié)構(gòu)中，雙歧桿菌相對豐度降低，糞腸球菌相對豐度增加[10]。有研究[11]認為，新診斷T2DM患者腸道菌群結(jié)構(gòu)中，梭狀芽胞桿菌的豐度增加，并降低了擬桿菌的相對豐度。此外，通過檢測T2DM患者血液中細菌16S rDNA水平，發(fā)現(xiàn)16S rDNA顯著升高，該研究表明腸道菌群通過改變腸道通透性，參與了T2DM的發(fā)生、發(fā)展[12]。在腎病晚期患者中發(fā)現(xiàn)，雙歧桿菌與嗜酸乳桿菌等有益菌數(shù)量減少、糞腸球菌等致病菌數(shù)量增加、炎癥因子也增加，表明T2DM患者處于腎病晚期時腸道菌群比例失調(diào)，有益菌的減少和致病菌的增加導致體內(nèi)炎癥狀態(tài)惡化，推動了2型糖尿病腎病的發(fā)展[13]。在本研究中，與對照組比較，B組小鼠腸道擬桿菌、疣微菌門豐度顯著下降，硬壁菌門、無壁[細]菌類、脫鐵桿菌門豐度上升；擬桿菌與硬壁菌門豐度降低。這些結(jié)果均表明，DN小鼠腸道細菌的菌群結(jié)構(gòu)受到了嚴重影響。

表4 種屬水平上各組小鼠腸道菌群相對豐度比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與B組比較，#P<0.05。

藥物及飲食干預可改變腸道菌群的結(jié)構(gòu)，并達到治療的效果。研究[14]表明，高脂飲食可顯著降低小鼠腸道菌群的多樣性，進食高纖維類食物可以增加腸道菌群的多樣性。二甲雙胍處理高脂飲食小鼠，可有效增加腸道中黏蛋白降解細菌AKKermansia Muciniphila菌相對豐度，改善糖耐受[17]。本研究中，A組小鼠尿白蛋白、尿素氮水平降低，推測纈沙坦具有保護糖尿病腎病小鼠腎臟的作用。進一步分析結(jié)果顯示，與B組比較，A組OTU總數(shù)、Chao1指數(shù)、Simpson指數(shù)降低，Shannon指數(shù)升高，說明纈沙坦可顯著影響糖尿病腎病小鼠腸道菌群多樣性。與B組比較，綱水平上A組小鼠腸道菌群擬桿菌、疣微菌門豐度上升，壁菌門、無壁[細]菌類、脫鐵桿菌門豐度下降。種屬水平上A組小鼠腸道菌群大腸桿菌志賀菌、阿克曼菌豐度上升，Mucispirillum菌豐度下降。這些結(jié)果均表明，纈沙坦可能通過影響腸道菌群的結(jié)構(gòu)，增加db/db小鼠的腸道菌群的多樣性,達到保護糖尿病腎病小鼠腎臟的作用。

綜上所述，纈沙坦灌胃的DN小鼠尿白蛋白、尿素氮均降低，纈沙坦灌胃的DN小鼠腸道菌群擬桿菌、疣微菌門、腸桿菌志賀菌和阿克曼菌豐度增加，硬壁菌門、無壁[細]菌類、脫鐵桿菌門、Mucispirillum菌豐度降低。纈沙坦可能通過增加DN小鼠腸道菌群多樣性、影響腸道菌群的結(jié)構(gòu)，對DN小鼠腎臟起保護作用。