李月潔，周鐵軍，劉艷，李雪，龔莉

(西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，四川瀘州646000)

OSCC是口腔腫瘤中最常見(jiàn)的組織學(xué)類型，約占口腔腫瘤的90%[1]。由于口腔頜面部淋巴管較豐富，約半數(shù)OSCC患者首診時(shí)已出現(xiàn)淋巴道轉(zhuǎn)移[2]，預(yù)后較差，5年生存率約60%。腫瘤干細(xì)胞(CSCs)是腫瘤細(xì)胞中一部分具有自我更新能力、多向分化潛能、高致瘤性和耐藥性的細(xì)胞，是腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的重要原因[3, 4]。CD133是一個(gè)具有五個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域的糖蛋白，最早在小鼠神經(jīng)干細(xì)胞及人造血干細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，但它不僅表達(dá)于正常干細(xì)胞，也表達(dá)于腫瘤的CSCs[5]，是認(rèn)可度較高的腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記物。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子C(VEGF-C)是血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子家族中的一員，可促進(jìn)血管生成，還可通過(guò)促進(jìn)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移促進(jìn)淋巴管生成和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[2, 6, 7]。有報(bào)道[8, 9]稱，CSCs可通過(guò)促進(jìn)VEGF-C的分泌促進(jìn)淋巴管生成和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。OSCC組織中VEGF-C與淋巴管生成的相關(guān)報(bào)道較少。我們觀察了OSCC組織CD133、VEGF-C的表達(dá)變化，分析其臨床意義?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院病理科2010年1月～2013年12月間收治的163例OSCC患者(觀察組)，其中男110例、女53例；年齡24～79歲，中位年齡58歲，≥60歲者72例，<60歲91例；病變部位為舌52例、頰49例、腭4例、唇6例、牙齦19例、口底33例；腫瘤直徑<4 cm者122例、≥4 cm者41例；病理分級(jí)為高分化77例，中分化52例，低分化34例；TNM分期為Ⅰ～Ⅱ期78例，Ⅲ～Ⅳ期85例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移72例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移91例。觀察組均行腫瘤切除術(shù)，術(shù)中保留癌組織石蠟標(biāo)本，術(shù)前均未接受任何放化療。另收集正?？谇火つな灲M織37例為對(duì)照組。兩組年齡、性別比例等一般資料具有可比性。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意。

1.2 試劑與方法 鼠抗人單克隆抗體CD133購(gòu)自武漢三鷹公司(66666-1-ig)，稀釋比例1∶500，EDTA修復(fù)；兔抗人多克隆抗體VEGF-C購(gòu)自Bioworld公司(BS7382)，稀釋比例1∶200，檸檬酸修復(fù)；鼠抗人單克隆抗體D2-40購(gòu)自北京中杉金橋公司(ZM-0465)，稀釋比例1∶100。Envision兩步法試劑盒(中杉金橋公司)，濃縮型DAB試劑盒(中杉金橋公司)。采用Envision二步法，切片常規(guī)脫蠟脫水，高壓熱修復(fù)，其余嚴(yán)格按說(shuō)明書(shū)執(zhí)行。

1.3 兩組OSCC組織CD133、VEGF-C檢測(cè) 采用免疫組化法。結(jié)果均由病理科兩名高年資主治醫(yī)師，單獨(dú)進(jìn)行評(píng)測(cè)。CD133及VEGF-C的陽(yáng)性表達(dá)主要位于細(xì)胞質(zhì)，呈淡黃色至棕黃色顆粒。CD133陽(yáng)性細(xì)胞≤10%計(jì)1分，10%<陽(yáng)性細(xì)胞≤33%計(jì)2分，34%<陽(yáng)性細(xì)胞≤66%計(jì)3分，陽(yáng)性細(xì)胞>67%計(jì)4分；染色強(qiáng)度為無(wú)著色計(jì)0，淡黃色計(jì)1分，棕黃色及2分，棕褐色計(jì)3分。兩相相乘結(jié)果0～3判為(-)，4～6判為(+)，7～9判為(++)；≥10判為(+++)[10]。VEGF-C陽(yáng)性細(xì)胞≤5%計(jì)0分，6%<陽(yáng)性細(xì)胞≤25%計(jì)1分，26%<陽(yáng)性細(xì)胞≤50%計(jì)2分，51%<陽(yáng)性細(xì)胞≤75%計(jì)3分，陽(yáng)性細(xì)胞>76%計(jì)4分。染色強(qiáng)度計(jì)分與CD133一致。上述兩種評(píng)分的乘積0～1為-、2～3為+、4～7為++；≥8為+++[11](染色強(qiáng)度需與背景相對(duì)比)。-判為陰性，+、++、+++判為陽(yáng)性。計(jì)算兩組CD133、VEGF-C陽(yáng)性表達(dá)率。陽(yáng)性表達(dá)率=陰性例數(shù)/總例數(shù)×100%。

1.4 兩組OSCC組織淋巴管密度(LVD)測(cè)算 測(cè)算兩組LVD，LVD定位于OSCC組織淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞，先在低倍鏡下觀察淋巴管數(shù)量最多的區(qū)域，即熱點(diǎn)區(qū)。在熱點(diǎn)區(qū)用200倍視野進(jìn)行觀察，隨機(jī)選取6個(gè)視野，分別計(jì)數(shù)淋巴管數(shù)量，求其平均值[12]。

2 結(jié)果

觀察組、對(duì)照組CD133陽(yáng)性表達(dá)率分別為66.26%、10.81%(P<0.05)。觀察組、對(duì)照組VEGF-C陽(yáng)性表達(dá)率分別為79.14%、21.62%(P<0.05)。觀察組、對(duì)照組LVD分別為7.66±3.54、3.53±1.05(P<0.05)。

CD133、VEGF-C表達(dá)與OSCC患者臨床病理學(xué)參數(shù)的關(guān)系見(jiàn)表1。CD133表達(dá)與OSCC患的臨床分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P均<0.05)。年齡<60、≥60歲OSCC患者LVD分別為7.57±3.37、7.77±3.77，男、女OSCC患者LVD分別為7.43±3.52、7.88±3.47，病變部位為舌、頰、腭、唇、牙齦、口底OSCC患者LVD分別為8.12±4.02、8.26±3.38、7.24±5.21、6.33±2.56、7.22±3.12、6.58±3.00，臨床分期為ⅠⅡ期、Ⅲ及Ⅳ期OSCC患者LVD分別為5.68±2.25、9.47±3.55，高、中、低分化OSCC患者LVD分別為7.32±3.53、8.32±3.72、7.41±3.26，腫瘤直徑<4 cm、≥4 cmOSCC患者LVD分別為7.51±3.44、7.50±3.58，有、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移OSCC患者LVD分別為10.21±3.18、5.64±2.18。LVD與OSCC患者臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P均<0.05)。

OSCC組織中CD133、VEGF-C的表達(dá)呈正相關(guān)(rs=0.46，P<0.05)。

OSCC患者中CD133陰性、陽(yáng)性者的LVD分別為5.60±1.56、8.71±3.80(P<0.05)。OSCC患者中VEGF-C陰性、陽(yáng)性者LVD分別為6.41±1.51、7.99±3.84(P<0.05)。

3 討論

口腔黏膜被覆復(fù)層鱗狀上皮，在生理狀況下細(xì)胞更新和受傷修復(fù)時(shí)，由位于上皮基底部的干細(xì)胞通過(guò)不對(duì)稱分裂產(chǎn)生的子代細(xì)胞定向分化進(jìn)行再生修復(fù)，使口腔黏膜保持完整性。CSCs具有自我更新、多向分化能力，在腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)、耐藥等過(guò)程中發(fā)揮重要作用，是惡性腫瘤浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的源泉。淋巴道轉(zhuǎn)移是大多上皮源性惡性腫瘤的主要轉(zhuǎn)移途徑，也是口腔鱗癌預(yù)后不良的重要原因。因此，誘導(dǎo)淋巴管生成是實(shí)體腫瘤發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移非常重要的條件，然而目前CSCs與淋巴管生成的關(guān)系還不甚清楚。

CD133蛋白是造血干細(xì)胞比較特異的標(biāo)記物。

表1 CD133、VEGF-C表達(dá)及LVD與OSCC患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系

高表達(dá)CD133的腫瘤細(xì)胞具有自我更新及多向分化等干細(xì)胞特性，因而 CD133被認(rèn)為是實(shí)體腫瘤中比較好的腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記物[13, 14]。本研究發(fā)現(xiàn)，觀察組、對(duì)照組CD133陽(yáng)性表達(dá)率分別為66.26%、10.81%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與Ravindran等[15]研究結(jié)果相近。進(jìn)一步分析CD133的表達(dá)與口腔鱗癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，其與口腔鱗癌的臨床分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。提示OSCC組織中存在CD133+的干細(xì)胞樣細(xì)胞，且該細(xì)胞在口腔鱗癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移過(guò)程中起著重要作用。

研究[16]發(fā)現(xiàn)，腫瘤干細(xì)胞可以通過(guò)刺激血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGFs)的分泌，促進(jìn)腫瘤血管的形成。而VEGF-C是血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子家族成員之一，其受體包括VEGFR-2和VEGFR-3。其中VEGFR-2 在淋巴管及血管內(nèi)皮細(xì)胞均有表達(dá)，而VEGFR -3 則主要在淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)。VEGF-C可通過(guò)與其受體VEGFR-3結(jié)合，使其發(fā)生自身磷酸化，再通過(guò)細(xì)胞質(zhì)內(nèi)信號(hào)傳遞，增加淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂活動(dòng)，誘導(dǎo)淋巴管的生成[17]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示口腔鱗癌組織及正常口腔黏膜中VEGF-C陽(yáng)性表達(dá)率分別為79.14%、21.62%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且其表達(dá)與口腔鱗癌的臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。進(jìn)一步分析VEGF-C與淋巴管密度的相關(guān)性發(fā)現(xiàn)，口腔鱗癌VEGF-C+組淋巴管密度顯著高于VEGF-C-組，提示VEGF-C可能參與了口腔鱗癌淋巴管生成的過(guò)程，促進(jìn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[18]。

在對(duì)人類膠質(zhì)細(xì)胞瘤的研究中，CD133+的干細(xì)胞樣膠質(zhì)瘤細(xì)胞能持續(xù)分泌VEGF，比CD133-的干細(xì)胞樣膠質(zhì)瘤細(xì)胞釋放更多的VEGF，并且在經(jīng)過(guò)缺氧誘導(dǎo)后發(fā)現(xiàn)，CD133+的干細(xì)胞樣膠質(zhì)瘤細(xì)胞分泌的VEGF會(huì)進(jìn)一步提高，提示CD133+的膠質(zhì)瘤干細(xì)胞能夠調(diào)控VEGF的分泌，從而調(diào)動(dòng)內(nèi)皮祖細(xì)胞，促進(jìn)局部血管生成[4]。而人類乳腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)CD44+/CD24-/low的干細(xì)胞樣細(xì)胞亞群中VEGF-C的水平更高[8]，提示腫瘤干細(xì)胞可能通過(guò)調(diào)控VEGF-C的分泌，調(diào)控淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖與遷移，促進(jìn)淋巴管的生成和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。例如在對(duì)淋巴水腫的動(dòng)物模型的研究中發(fā)現(xiàn)，經(jīng)VEGF-C誘導(dǎo)培養(yǎng)后的脂肪干細(xì)胞，可以向淋巴組織分化，形成新生淋巴管[19]，同樣在腎細(xì)胞癌、乳腺癌、卵巢癌的研究中也發(fā)現(xiàn)，在加入VEGF-C的誘導(dǎo)培養(yǎng)條件下，腫瘤干細(xì)胞可以發(fā)生轉(zhuǎn)分化，產(chǎn)生具有內(nèi)皮細(xì)胞表型及功能特征的子代細(xì)胞[9]，提示在高表達(dá)VEGF-C的腫瘤微環(huán)境中，腫瘤干細(xì)胞可能發(fā)生轉(zhuǎn)分化，并逐步形成新生淋巴管，進(jìn)而促進(jìn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的發(fā)生。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)在口腔鱗癌組織中CD133及VEGF-C的表達(dá)具有正相關(guān)關(guān)系，在高表達(dá)CD133的口腔鱗癌組織中VEGF-C呈高表達(dá)水平，提示在口腔鱗癌腫瘤微環(huán)境中CD133+干細(xì)胞樣口腔鱗癌細(xì)胞亞群可能與VEGF-C相互影響，相互作用，最終發(fā)揮促進(jìn)淋巴管生成及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的作用。 口腔鱗癌腫瘤微環(huán)境中CD133+的干細(xì)胞樣口腔鱗癌細(xì)胞亞群可能是誘導(dǎo)腫瘤淋巴管生成，促進(jìn)腫瘤發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的重要病理過(guò)程中的始動(dòng)因素，也可能是該過(guò)程中的關(guān)鍵一環(huán)。

綜上所述，OSCC組織中CD133、VEGF-C呈高表達(dá)狀態(tài)，CD133、VEGF-C可能與腫瘤淋巴管生成與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。